西替利嗪對鼻息肉細胞中JAK/STAT信號及NF-κB表達的影響

賈全凡，袁 龍，劉冬梅，常藝瓊

(四川省廣元市中心醫院耳鼻咽喉-頭頸外科 628000)

鼻息肉病是臨床常見的鼻部黏膜慢性炎癥，患者常因鼻腔堵塞導致鼻阻、頭痛等癥狀，部分患者伴哮喘、中耳炎等并發癥[1]。酪氨酸激酶JAK/轉錄因子STAT信號(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)屬于重要的細胞內信號轉導通路，在細胞生理反應中發揮重要作用[2]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) 屬于核轉錄調控因子，為炎性反應中的重要介質[3]。近年來研究顯示，JAK/STAT、NF-κB的激活與鼻息肉的發生有著密切聯系，但具體作用機制目前尚未闡明[4]。本研究體外培養鼻息肉細胞，并給予西替利嗪處理，探究西替利嗪對鼻息肉細胞中JAK/STAT信號及NF-κB表達的影響，為鼻息肉的治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2017年8月在本院耳鼻喉科進行治療的40例鼻息肉病患者為試驗組，其中男22例，女18例，年齡23～65歲，平均(43.59±7.23)歲。患者組織分型均為Ⅱ型，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期6例，患者均進行手術治療獲取鼻息肉組織。另選取同期在本院進行鼻中隔手術的27例正常中鼻甲標本作為對照組，其中男16例，女11例，年齡24～62歲，平均(43.26±8.17)歲。以上納入患者均知情同意，無哮喘、過敏性鼻炎等病史，近期1個月內未服用抗組胺藥物或糖皮質激素。兩組患者在性別、年齡方面比較，差異無統計學意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DMEM培養基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自碧云天生物技術研究所；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)、蛋白酪氨酸激酶(Janus kinase 3，JAK3)、磷酸化JAK-3(p-JAK3)、信號傳導轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、NF-κB p50、NF-κB p65抗體購自于美國Santa Cruz公司；B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗購自于美國R&D公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自于美國Thermo Fisher Scientific公司；RT-PCR檢測試劑盒購自于日本Takara公司；蛋白凝膠成像儀購自于美國Bio-Red公司；細胞流式儀購自于美國Thermo公司。

1.2.2 試驗方法

1.2.2.1 鼻息肉細胞原代培養 取出保存鼻息肉組織、正常中鼻甲組織，置于含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗后，將組織剪碎，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化液放置4 ℃冰箱中消化12～16 h，輕柔吹打組織塊，細胞脫落后，在細胞懸液中加入胎牛血清，置于離心機中1 000 r/min離心5 min，添加10%胎牛血清DMEM培養基，置于37 ℃ 5%CO2培養箱中進行培養，當細胞生長至90%時，更換新鮮培養液，放置在5%CO2、1%O2細胞培養箱內進行培養，當細胞培養至第3代時可用于后續研究。

1.2.2.2 Western blot檢測JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65的表達 收集培養后細胞培養液，離心后加入蛋白裂解液反應30 min，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配制12%分離膠、5%濃縮膠，將蛋白樣品與Loading buffer 1∶4混勻后上樣，蛋白上樣量為20 μg，起始電壓設置為80 V。待樣品指示劑進入分離膠時，將電壓升高至120 V。電泳結束后，將蛋白凝膠轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃條件下進行轉膜反應，電壓設置80 V，轉膜時間為90 min。結束后用Tris緩沖生理鹽水吐溫(TBST)溶液清洗蛋白凝膠，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉90 min。TBST溶液清洗后，加入一抗，4 ℃過夜；TBST清洗后加入二抗，室溫下孵育90 min；TBST清洗后滴加電化學發光(ECL)發光液顯色，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達情況。

1.2.2.3 細胞增殖測定 收集培養至對數期鼻息肉細胞，制備單細胞懸液添加至96孔培養板，調整細胞密度為5×104/孔，在37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h，棄上清液，向孔內加入2.5×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L西替利嗪(分別為西替利嗪低、中、高濃度組)，對照組不進行藥物處理，繼續培養48 h后，向孔內加入20 μL CCK8溶液，繼續培養48 h后，在酶標儀中檢測450 nm處吸光度值。

1.2.2.4 細胞凋亡檢測 細胞處理后繼續培養48 h加入胰蛋白酶進行消化，調整細胞密度為1×106/mL，用預冷PBS清洗2次后，加入70%乙醇溶液固定過夜，PBS清洗細胞后加入異硫氰酸熒光素(FITC)，避光下孵育20 min，與細胞流式儀中觀察細胞凋亡情況。

表1 JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平

a：P<0.05，與正常中鼻甲細胞比較

表2 各組鼻息肉細胞增殖水平比較

a：P<0.05，與對照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

1.2.2.5 細胞免疫熒光試驗 細胞處理后繼續培養48 h，制備細胞爬片，PBS清洗3次，每次清洗3 min，置于4%多聚甲醛中固定15 min。PBS再次清洗3次，每次清洗3 min，隨后加入0.5%Triton X-100室溫放置20 min。PBS又清洗3次，每次清洗3 min，晾干后滴加山羊血清，室溫下封閉30 min，用濾紙吸走封閉液后滴加一抗，4 ℃過夜孵育。次日PBS清洗3次，每次清洗3 min，加入熒光二抗，37 ℃孵育1 h，避光下加入4,6-聯脒-2苯基吲哚(DAPI)孵育5 min，磷酸鹽緩沖液吐溫20(PBST)清洗4次，每次清洗5 min，晾干后置于熒光顯微鏡下觀察保存圖像。

1.2.2.6 西替利嗪對鼻息肉細胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2、Bax的表達 西替利嗪處理后，繼續培養48 h，收集細胞培養液，離心后保留下層細胞沉淀，參照1.2.2.3方法進行蛋白表達檢測。

2 結 果

2.1 鼻息肉細胞及正常中鼻甲細胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平比較 兩種細胞中JAK3、STAT3蛋白水平無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。與正常中鼻甲細胞相比，鼻息肉細胞中p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65蛋白水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 西替利嗪對鼻息肉細胞增殖的影響 隨著細胞培養時間延長，西替利嗪各濃度組細胞抑制率逐漸升高。在同一時間點，與對照組相比，西替利嗪各組隨著處理劑量的升高，細胞抑制率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 西替利嗪對鼻息肉細胞凋亡的影響 與對照組相比，西替利嗪處理組細胞凋亡率逐漸升高，且隨著處理劑量的增加逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表3。

A：對照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖1鼻息肉細胞凋亡情況

A：對照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖2 鼻息肉細胞中STAT3免疫熒光檢測(×100)

a：P<0.05，與對照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

A：對照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖3鼻息肉細胞中NF-κB p65免疫熒光檢測(×100)

2.4 細胞免疫熒光檢測鼻息肉細胞中STAT3、NF-κB p65表達 免疫熒光檢測顯示，STAT3、NF-κB p65在對照組細胞中主要定位在細胞核中，經西替利嗪處理后，STAT3、p65逐漸向細胞質中移動，隨著處理劑量的增加，細胞質熒光強度增強，見圖2、3。

2.5 西替利嗪對鼻息肉細胞中JAK/STAT信號、NF-κB、Bcl-2、Bax表達的影響 4組JAK3、STAT3蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，西替利嗪處理組p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2蛋白表達均降低，Bax蛋白表達升高，且具有劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、表4。

A：對照組；B：西替利嗪低濃度組；C：西替利嗪中濃度組；D：西替利嗪高濃度組

圖4 鼻息肉細胞中JAK3、p-JAK3、STAT3、

a：P<0.05，與對照組比較;b：P<0.05，與西替利嗪低濃度組比較;c：P<0.05，與西替利嗪中濃度組比較

3 討 論

抗組胺藥物為臨床治療鼻炎、過敏性鼻炎的主要藥物，第1代抗組胺藥物雖然有一定的效果，但具有嚴重毒副作用，如心臟毒性[5]。西替利嗪屬于抗組胺第2代藥物，為高選擇性H1受體拮抗劑，可選擇性與靶細胞H1受體結合，進而發揮抗組胺作用。與第1代藥物相比，其對胃腸、心臟、頭部的不良反應明顯減弱，且半衰期增長，藥效持久，在鼻炎、過敏性鼻炎中治療效果較好[6-7]。基于此，本研究通過離體培養鼻息肉細胞，并給予西替利嗪處理，以觀察其對鼻息肉細胞增殖的影響及與JAK/STAT信號、NF-κB通路的關系，以探究西替利嗪作用機制。

JAK/STAT信號通路在多類細胞生長、分化、凋亡及炎性反應發生中發揮著重要作用。細胞因子與受體結合后形成二聚體且與JAK靠近，進而被酪氨酸殘基磷酸化，吸引轉錄因子STAT與受體結合，使STAT磷酸化并與受體解離形成二聚體，逐漸轉移至細胞核內參與下游靶基因的調控，因而JAK的磷酸化后能夠激活STAT磷酸化，進而發揮生物學作用[8-10]。過往研究顯示在鼻息肉形成過程中炎癥細胞釋放的炎癥介質激活JAK進而激活STAT3，放大炎性反應[11]。本研究結果顯示在鼻息肉細胞中p-JAK3、p-STAT3明顯高于正常中鼻甲細胞，根據以往研究結果推測，STAT3可能與鼻息肉的發生有關。進一步研究顯示西替利嗪處理后鼻息肉細胞增殖明顯受到抑制，且p-JAK3、p-STAT3蛋白表達降低，免疫熒光檢測顯示STAT3逐漸向細胞質中轉移，表明JAK/STAT信號通路參與鼻息肉的發生，西替利嗪可通過抑制JAK/STAT信號通路的磷酸化，進而抑制鼻息肉細胞的增殖。

NF-κB屬于重要核轉錄因子，在炎性、免疫反應中發揮重要作用，一般以p50-p65異二聚體的形式存在于細胞質。NF-κB被激活后逐漸轉移至核內，與DNA啟動位點結合調控細胞因子轉錄，NF-κB被激活后可大量分泌炎癥介質，進而調控多種炎癥因子表達[12-13]。CHO等[14]研究表明，鼻息肉組織中NF-κB 呈陽性表達，其可以通過調控白細胞介素(IL)-1、IL-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細胞因子的轉錄擴大炎性反應，促進鼻息肉的發生、發展。本試驗結果顯示，鼻息肉組織中NF-κB p50、NF-κB p65蛋白有較強的表達，明顯高于正常中鼻甲細胞，且經西替利嗪處理后可明顯降低其蛋白表達，免疫熒光檢測顯示西替利嗪粗粒后NF-κB逐漸向細胞質中轉移，表明在鼻息肉的發生中，轉錄因子NF-κB 的激活可能為中心環節，其激活可介導炎癥介質的釋放和活化，形成炎癥級聯反應，致使鼻息肉的發生、發展。本研究結果提示可通過西替利嗪抑制 NF-κB 蛋白的活性，以緩解鼻息肉發展。

鼻息肉組織中存在細胞增殖、凋亡失衡，以往對鼻息肉凋亡相關研究主要集中于凋亡障礙研究上，對于鼻息肉中促進細胞凋亡研究較少[15]。卞俊杰等[16]研究顯示鼻息肉上皮細胞中存在細胞凋亡，且通過蛋白檢測顯示鼻息肉組織中Bcl-2、Bax蛋白陽性表達率均較高。大量研究證實凋亡有關因子Bcl-2、Bcl-xl、髓細胞白血病基因1(Mcl-1)、Survivn均為STAT3信號通路下游靶基因，STAT3可對以上凋亡相關蛋白進行調控促進細胞的增殖或凋亡，進而參與腫瘤及其他疾病的發生[17]。YANG等[18]研究顯示通過抑制STAT3活性能夠降低抑制Bcl-2的表達。本研究顯示西替利嗪處理組p-JAK3、p-STAT3、NF-κB p50、NF-κB p65、Bcl-2蛋白表達均降低，Bax蛋白表達升高，且具有劑量依賴性，表明西替利嗪處理后可抑制JAK/STAT信號通路，促進凋亡蛋白的表達進而促進鼻息肉細胞的凋亡，提示西替利嗪可誘導鼻息肉細胞凋亡。

綜上所述，西替利嗪能夠抑制鼻息肉細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與抑制JAK/STAT信號、NF-κB表達，促進凋亡蛋白的表達相關。但鼻息肉病的發病機制較復雜，所涉及的具體機制還有待后續深入研究。