FANCJ在HEK293T細胞中的表達、純化及活性檢測

袁濮玉，撖 榮，杜佳慧，儲小玲，吳 潔，楊 凡，蘇 倩，邱橋成，薛勝利△，劉松柏▲

(1.蘇州衛生職業技術學院蘇州檢驗醫學生物技術重點實驗室 215009；2.蘇州大學附屬第一醫院血液科，蘇州 215006)

FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因編碼的蛋白是第1個被確認的同乳腺癌相關腫瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相結合的蛋白，因此其最初被命名為BRCA1結合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；隨后又被命名為BRCA1相互影響的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有類似名稱的轉錄因子相混淆；而近年來該蛋白被發現是范可尼貧血(fanconi anemia，FA)通路的成員之一，故被稱為FANCJ蛋白[1-3]。FANCJ是一種ATP依賴的5′-3′DNA解旋酶，最初從FA和早發性乳腺癌患者中鑒定出來一些錯義突變位點(A349P,R251C,Q255H，P47A，M299I等)，這暗示FANCJ蛋白可能作為腫瘤抑制因子維持基因組的穩定性[4-5]。隨后的研究表明，FANCJ蛋白在DNA鏈間交聯(interstrand cross-link，ICL)修復、復制脅迫響應及G4-DNA結構拆解過程中發揮重要功能[6-8]。FANCJ編碼的序列突變與乳腺癌發生緊密相關，在大量的FANCJ-like解旋酶結構域中發現Fe-S簇結構域，已經證實了 FANCJ在motifⅠ、Fe-S和BRCA1互作的結構域發生錯義突變，與乳腺癌及FA的發生有關[9-10]。遺傳學研究證實，N端Fe-S簇結構域(aa276-aa362)及MLH1結合區(aa128-aa158)與FANCJ解旋酶活性相關，而非BRCA1結合區[2]。體外生化實驗發現A349P、R251C、Q255H等錯義突變失去了DNA解旋酶活性，而M299I突變體蛋白的ATP水解酶活性及DNA解旋酶活性都比野生型高，從而為闡明疾病發生的機制奠定了基礎[11-14]。

在對急性髓系白血病(AML)患者基因圖譜的研究過程中發現，FANCJ基因的編碼區c.A587G:p.N196S位置在AML患者中出現了復現性錯義突變。但這種突變對活性的影響尚不明確。N196S突變位于與ATP結合的區域，可能對活性造成一定影響。因此，本研究構建了FANCJ及N196S突變體表達質粒，并對在HEK293T細胞中表達純化的蛋白進行了DNA解旋酶活性檢測，為進一步研究FANCJ在白血病發生過程中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 plvx-EF1-MCS-PGK-PURO載體購自廣州輝駿生物科技有限公司，FANCJwt編碼區全長基因特異性引物(FANCJF:5′-TCG AGC TCA AGC TTC GAA TTC ATG TCT TCA ATG TGG TCT G-3′;FANCJR:5′-TTA TCT AGA GTC GCG GGA TCC TTA CTT AAA ACC AGG AAA CAT G-3′),N196S點突變構建特異性引物(FANCJ-N196S/F:5′-GTA AAA CTC AGC TCT CCA CTG-3′;FANCJ-N196S/R:5′-AGT CTT TCC TGA ATC AAC-3′)，以及熒光標記DNA底物均在華大基因科技公司合成；HEK293T細胞購自上海拜力生物科技公司，大腸桿菌感受態DH5α購自北京全式金生物技術公司，Polyjet購自美國SignaGen公司，限制性內切酶ECORⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、DpnⅠ及T4 DNA連接酶均購自美國NEB公司，ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶購自諾唯贊生物公司，PCR、質粒提取試劑盒購自天根生物公司，Flag單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、3xFlag肽段購自英國Abcam公司，M2 Beads購自美國Sigma公司，銀染試劑盒購自碧云天生物公司。細胞培養基及血清的細胞培養相關試劑均購自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 FANCJwt及N196S突變體真核表達載體的構建 選取HEK293T細胞來源的cDNA片段，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增出相應的FANCJwt編碼區全長片段，瓊脂糖電泳鑒定DNA條帶并膠回收。ECORⅠ、BamHⅠ雙酶切plvx-EF1-MCS-PGK-PURO載體，并純化回收酶切產物。將酶切后的表達載體及PCR酶切片段利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit在37 ℃條件下反應30 min，連接產物轉化到DH5α感受態中，并涂到帶有氨芐抗性的LB平板上，在37 ℃培養箱中過夜，挑選單個菌落進行質粒酶切，測序驗證成功的質粒用于后續N196S突變體質粒的構建及接下來的轉染。N196S突變體質粒以FANCJwt質粒為模板，利用點突變引物進行PCR擴增，擴增后的產物進行DpnⅠ酶解,然后轉化到DH5α感受態中進行與以上相同的后續檢測操作。

1.2.2 細胞培養及脂質體轉染 HEK293T細胞常規培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，前1 d細胞鋪于15 cm培養板中，等細胞密度至70%～80%時，瞬時轉染FANCJwt及N196S表達質粒(按照美國SignaGen公司的Polyjet轉染說明書進行轉染)。

1.2.3 提取總蛋白及蛋白質印跡法(Western blot)檢測 轉染36～48 h后，棄掉上清液培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次。刮刀收集細胞并加入適量RIPA裂解液，振蕩15 s后置于冰上30 min。12 000×g于4 ℃離心30 min，將裂解液上清液轉移到另外一個新的EP管中，利用二辛可寧酸(BCA)方法進行蛋白定量。取50 μg總蛋白經10% SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離，100 V情況下利用濕轉方法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，每次10 min。加入一抗anti-Flag抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(1∶2 000)二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。增強化學發光法(ECL)顯色和發光(Odyssey Fc成像儀，Gene公司，美國)。

1.2.4 免疫沉淀純化蛋白與PAGE銀染 FANCJwt及突變體N196S表達質粒在HEK293T細胞中轉染36～48 h后收集細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃離心獲得總蛋白上清液，在上清液中加入20 μL M2 Beads，4 ℃旋轉過夜，利用預冷PBS漂洗M2 Beads 3次，然后加入30 μL 3xFlag肽段競爭洗脫Flag-FANCJwt及Flag-N196S蛋白，獲得的純化蛋白用于活性檢測及PAGE膠銀染(按照碧云天生物公司的快速銀染說明書進行銀染)。

1.2.5 DNA解旋酶活性檢測 DNA解旋酶活性檢測采用熒光標記Oligo DNA底物的方法，上下游oligo序列為：DC26(上游)，5′-TAMRA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCC CAG TAA AAC GAC GAC GGC CAG TGC-3′；Tstem25(下游)，5′-GCA CTG GCC GTC GTT TTA CGG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CG3-3′。反應前將退火后的DNA底物及反應緩沖液混合在一起，30 ℃情況下水浴反應1 h，然后用加入乙二胺四乙酸(EDTA)及蛋白酶K的6×DNA上樣緩沖液進行終止反應。反應產物通過非變性PAGE膠進行分離，分離后的結果通過熒光成像儀進行觀察(Odyssey Fc成像儀，Gene公司)。

2 結 果

2.1 通過PCR擴增獲得FANCJwt基因cDNA編碼區全長 以HEK293T細胞來源的cDNA片段為模板，應用設計的引物進行人源FANCJwt基因PCR擴增，可見3.7×103大小的特異性片段，見圖1。

2.2 FANCJwt真核表達載體及N196S突變體構建鑒定 利用FANCJwt表達質粒為模板，通過點突變引物進行PCR擴增，獲得的質粒進行測序，鑒定FANCJ基因cDNA 第587位由 A突變為 G，相應氨基酸由N(天冬氨酸)突變為S(絲氨酸)，突變成功。FANCJwt及N196S真核表達載體plvx-EF1-MCS-PGK-PURO，經XbaⅠ酶切后得到約2.5×103(片段)及9.9×103(載體)的兩條條帶。見圖2。

M:DNA分子標記物;N1:陰性對照組1;N2:陰性對照組2;1:PCR產物

圖1目的基因PCR擴增

M:DNA標準條帶; 1:FANCJwt;2:FANCJ 質粒經XbaⅠ酶切產物; 3:FANCJwt;4:N196S質粒經XbaⅠ酶切產物

圖2酶切驗證(A)及突變測序驗證(B)

2.3 FANCJwt及N196S突變體蛋白在HEK293T細胞中的表達 將構建成功的FANCJwt及N196S突變體表達質粒轉染到HEK293T細胞中，Western blot檢測到蛋白的成功表達，見圖3A。

圖3 Western blot檢測(A)及蛋白純化銀染成像(B)

2.4 免疫沉淀方法純化FANCJwt、N196S突變體蛋白及PAGE膠銀染 FANCJwt及突變體N196S表達質粒在HEK293T細胞中轉染表達后收集細胞，裂解細胞并提前總蛋白，使用M2 Beads沉淀帶Flag標簽的FANCJwt及突變體N196S蛋白，然后通過3xFlag肽段將蛋白競爭洗脫下來，洗脫下來的蛋白經銀染染色，檢測到明顯的FANCJwt及突變體N196S蛋白條帶，見圖3B。

2.5 DNA解旋酶活性檢測 采用熒光標記Oligo DNA底物的方法(圖4A)，對FANCJwt及突變體N196S蛋白進行了DNA解旋酶活性檢測，發現與FANCJwt野生型相比，N196S突變體活性明顯增強，并疑似具有額外核酸酶活性(產物2)，見圖4B。

圖4 DNA底物(A)及解旋酶活性檢測(B)

3 討 論

FANCJ在FA、乳腺癌及急性髓系白血病中都存在復現性的錯義突變。因此，在不同類型的癌癥中，FANCJ都被認為參與了疾病的發生、發展進程，受到了廣泛關注。FANCJ具有DNA解旋酶活性，參與包括FA通路在內的多個DNA修復通路，在多種癌癥患者中檢測到的錯義突變體也顯示與DNA解旋酶活性的改變相關[5,10]。本課題組前期研究中在急性髓系白血病患者中檢測到了一種復現性的N196S錯義突變，位于與ATP結合的區域，靠近Fe-S結構域及與MLH1結合的區域，之前少見報道，對FANCJ功能的具體影響目前尚不清楚。因此構建FANCJWT及其突變體的表達載體，純化蛋白并檢測蛋白的解旋酶活性，將為后續FANCJ在白血病發生過程的研究中奠定基礎[12]。本研究中，采用HEK293T細胞來源的cDNA片段作為模板擴增出相應的FANCJwt基因序列，將其與plvx-EF1-MCS-PGK-PURO真核表達載體相連，并以此FANCJWT野生型表達質粒為模板，構建了N196S表達載體，轉入HEK293T細胞。通過Western blot及銀染檢測證明成功表達純化了兩種蛋白。后續通過熒光標記DNA底物的方法成功檢測到FANCJwt及N196S突變體蛋白解旋酶活性存在差異性，這為后續研究FANCJ突變導致白血病發生的機制奠定基礎。總之，本研究結果將為進一步研究FANCJWT及N196S突變體在急性髓系白血病發生、發展過程中的作用機制奠定基礎，也為研究FANCJ生物學功能提供了新的思路。