攜白細(xì)胞介素-8單克隆抗體靶向造影劑對(duì)兔急性心肌梗死模型的超聲評(píng)估

陳建福，張容亮，孫 月，陸永萍

(云南省第二人民醫(yī)院超聲科，昆明 650021)

冠心病(coronary heart disease，CHD)亦稱缺血性心臟病，是當(dāng)今危害人類健康和生命最主要的疾病之一，其中以急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的影響最大[1]，全世界每年至少有1 700萬人死于AMI及其并發(fā)癥，位列死亡原因之首。如何快速、準(zhǔn)確地診斷出AMI及確定梗死區(qū)域是目前研究的重點(diǎn)。研究表明，白細(xì)胞介素-8(IL-8)是參與心肌梗死重要的炎性因子[2]，也是一種趨化因子。本實(shí)驗(yàn)擬開胸結(jié)扎兔左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending，LAD)建立兔AMI模型，應(yīng)用臨床上常用的SonoVue造影劑偶聯(lián)IL-8單克隆抗體(簡(jiǎn)稱“IL-8單抗”)制備靶向超聲造影劑[3]，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行心肌聲學(xué)造影(MCE)檢查，并根據(jù)顯影情況，第一時(shí)間進(jìn)行視覺評(píng)估，從而快速、精確地判斷梗死區(qū)域，為臨床進(jìn)一步研究AMI奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年日本大耳兔32只，體質(zhì)量(3.0±0.5)kg，隨機(jī)分為兩組：AMI模型組和假手術(shù)(Sham)對(duì)照組，每組16只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Philips iE33超聲診斷儀，S5-1探頭，頻率1.8/3.6 MHz。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 AMI組：3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射麻醉后，消毒、鋪巾，于兔胸骨左緣3、4肋骨水平作長3～4 cm的縱形切口,依次切開皮膚、皮下組織，分離肌肉層，充分暴露心包，剪開心包暴露心臟的手術(shù)視野，用5-0 Prolene帶針縫線連同心大靜脈一起結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。肉眼觀察結(jié)扎遠(yuǎn)端局部心肌顏色出現(xiàn)暗紅色，再變成暗紫色且搏動(dòng)減弱，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)兔心電圖波形出現(xiàn)ST段上抬、壓低或病理性Q波，初步判斷模型成功建立[4]。Sham組：同一結(jié)扎點(diǎn)只穿線不結(jié)扎。AMI組和Sham組兔均行四肢電極連接MEDLAB-4C501H型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，行心電監(jiān)護(hù)。

1.2.2 靶向造影劑的制備

1.2.2.1 造影劑制備 采用共價(jià)偶聯(lián)法通過異型雙功能交聯(lián)劑(SPDP)將IL-8單抗偶聯(lián)于SonoVue微泡表面，獲得攜IL-8單抗的微泡懸液[5]，制備靶向超聲造影劑。

1.2.2.2 微泡懸液的鑒定 (1)玻片凝集實(shí)驗(yàn)鑒定：攜IL-8單抗的偶聯(lián)造影劑微泡懸液與羊抗鼠IgG血清混合，倒置顯微鏡下可觀察到凝集反應(yīng)[6]；單純SonoVue造影劑微泡懸液與羊抗鼠IgG血清混合液倒置顯微鏡下未觀察到凝集反應(yīng)。(2)熒光染色實(shí)驗(yàn)鑒定：攜IL-8單抗的偶聯(lián)造影劑微泡懸液表面可見熒光，單純SonoVue造影劑微泡未見熒光。

1.3 超聲心動(dòng)圖及MCE檢查 各實(shí)驗(yàn)兔分別于術(shù)前，術(shù)后30 min、2 h、6 h行常規(guī)心臟超聲檢查，先行SonoVue造影劑MCE檢查，間隔10 min，行攜IL-8單抗靶向造影劑MCE檢查。兩種造影劑(SonoVue造影劑、IL-8單抗+SonoVue偶聯(lián)造影劑)使用前搖勻，每次均抽取0.2 mL微泡懸液(約0.05 mL/kg)，經(jīng)兔耳緣靜脈10 s內(nèi)勻速推注完，并用2 mL生理鹽水沖注。取左室短軸乳頭肌水平切面觀察心肌各節(jié)段顯影，檢查過程中的動(dòng)靜態(tài)圖像全部存儲(chǔ)用于視覺分析評(píng)估。全分析過程采用盲法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物只用編號(hào)，不標(biāo)明分組。

1.4 心肌造影劑充盈視覺評(píng)估 +++：心肌造影劑顯影明顯，視頻強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，接近左心腔內(nèi)造影劑強(qiáng)度；++：心肌造影劑顯影一般，視頻強(qiáng)度低于左心腔內(nèi)造影劑強(qiáng)度；+：心肌造影劑顯影暗淡，視頻強(qiáng)度明顯低于左心腔內(nèi)造影劑強(qiáng)度；-：心肌不顯影。

2 結(jié) 果

2.1 模型建立情況 Sham組3只死亡，其中1只開胸后即死，可能與麻醉劑量不當(dāng)有關(guān)，另2只于術(shù)中胸膜破裂死亡。AMI組4只死亡，其中2只于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎約1、3 h后死亡，可能與麻醉劑量不當(dāng)、AMI面積過大等有關(guān)，另2只于術(shù)中胸膜破裂死亡。最后納入實(shí)驗(yàn)分析的模型有25只，Sham組13只，AMI組12只。

2.2 視覺評(píng)估

2.2.1 SonoVue造影劑心肌造影視覺評(píng)估 AMI組的造影劑顯影程度明顯低于Sham組，見圖1。

橙色箭頭所示：AMI組造模節(jié)段前壁心肌顯影的充盈缺損區(qū)

圖1 Sham組和AMI組術(shù)后6 h心肌聲學(xué)造影圖

2.2.2 攜IL-8單抗的靶向造影劑行心肌造影視覺評(píng)估 攜IL-8單抗靶向造影劑行MCE檢查，AMI組各節(jié)段心肌造影劑充盈情況的視覺評(píng)估術(shù)前各節(jié)段造影劑充盈均一致，視頻強(qiáng)度整體偏低(與偶聯(lián)造影劑的微泡密度相對(duì)偏低有關(guān))；AMI組術(shù)后30 min，兩造模節(jié)段前壁、前間隔充盈初期即可見造影劑充盈，中期即達(dá)峰值，中期至峰值期表現(xiàn)為平臺(tái)；全部充盈過程，視頻強(qiáng)度均強(qiáng)于術(shù)前，前間隔與前壁強(qiáng)于后間隔與下壁。術(shù)后2、6 h視覺評(píng)估與術(shù)后30 min相似，見表1。AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑及SonoVue造影劑行MCE檢查造影劑顯影情況比較，術(shù)前兩種造影劑造模節(jié)段呈相似均勻一致充填；術(shù)后30 min，兩個(gè)造模節(jié)段攜IL-8單抗靶向造影劑顯影視頻強(qiáng)度均強(qiáng)于SonoVue造影劑；術(shù)后2、6 h視覺評(píng)估與術(shù)后30 min相似，見表2。術(shù)后30 min，Sham組心肌前壁未見明顯造影劑充盈，AMI組可見造影劑充盈；術(shù)后2、6 h視覺評(píng)估與術(shù)后30 min相似，見圖2。術(shù)后30 min，Sham組心肌前間隔未見明顯造影劑充盈，AMI組可見造影劑充盈。術(shù)后2、6 h視覺評(píng)估與術(shù)后30 min相似，見圖3。

表1 AMI組各節(jié)段心肌造影劑充盈情況的視覺評(píng)估

黃色虛線區(qū)：造模節(jié)段前壁心肌充盈初期

圖2 Sham組和AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑

黃色虛線區(qū)：造模節(jié)段前間隔心肌充盈初期

圖3 Sham組和AMI組攜IL-8單抗靶向造影劑心肌前間隔術(shù)后聲學(xué)造影圖

3 討 論

AMI是由于冠狀動(dòng)脈急性閉塞而導(dǎo)致部分心肌缺血性壞死的過程，常發(fā)生在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上[7]。心肌缺血、梗死部位常釋放出多種炎性因子。研究證明，AMI后會(huì)出現(xiàn)血清IL-8水平升高,IL-8是參與心肌梗死的重要炎性因子[8-9]。本研究通過將IL-8單抗連接到聲學(xué)造影劑表面構(gòu)筑成靶向聲學(xué)造影劑，使造影劑快速、主動(dòng)結(jié)合到靶區(qū)，從而進(jìn)行特異性的超聲分子成像，以期準(zhǔn)確、及時(shí)地判斷局部室壁運(yùn)動(dòng)異常區(qū)域內(nèi)有無存活心肌，為臨床選擇治療措施、療效預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供重要的依據(jù)[10]。

傳統(tǒng)二維超聲心動(dòng)圖可以顯示出心室壁各部分的運(yùn)動(dòng)，檢出心肌梗死所致的室壁運(yùn)動(dòng)異常[11],但是無法在第一時(shí)間精確地診斷出心肌梗死的具體區(qū)域。行心肌超聲造影檢查時(shí)，某一區(qū)域心肌的視頻密度代表了該區(qū)域即時(shí)造影劑的濃度,因此可用MCE檢查判斷心肌血供情況[12]。當(dāng)心肌微循環(huán)尚未受損時(shí)，心肌內(nèi)可見聲學(xué)造影劑均勻充盈；當(dāng)心肌梗死時(shí)，由于血供不足或中斷，局部節(jié)段心肌出現(xiàn)造影劑灌注缺損，顯影視頻強(qiáng)度明顯減弱[13]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，同一實(shí)驗(yàn)兔，單用SonoVue造影劑行MCE檢查時(shí)，AMI組造模節(jié)段的心肌顯影視頻強(qiáng)度均低于術(shù)前，均低于Sham組；AMI組造模節(jié)段的心肌顯影視頻強(qiáng)度均低于非造模節(jié)段。而用攜IL-8單克隆抗體的靶向造影劑行MCE檢查時(shí)，AMI組造模節(jié)段的心肌顯影視頻強(qiáng)度均高于術(shù)前，均高于Sham組；AMI組造模節(jié)段的心肌顯影視頻強(qiáng)度均高于非造模節(jié)段。在造影劑單因素不同，其他實(shí)驗(yàn)因素都相同的情況下，可說明IL-8單克隆抗體與缺血心肌釋放的炎性因子IL-8之間的補(bǔ)體效應(yīng)所致的趨化性和靶向作用。

用攜IL-8單抗的靶向造影劑行心肌聲學(xué)造影時(shí)，AMI組術(shù)后30 min即表現(xiàn)為造模節(jié)段造影劑充盈明顯強(qiáng)于非造模節(jié)段，充盈速度快于非造模節(jié)段。但從心肌微循環(huán)的角度來看，AMI組術(shù)后30 min造模節(jié)段的微循環(huán)受損并減少[14]，而側(cè)支循環(huán)尚未完全建立，MCE本應(yīng)表現(xiàn)為充盈缺損或充盈程度低于非梗死區(qū)，而實(shí)際卻相反，由此分析得出炎性因子IL-8在AMI早期(術(shù)后30 min)增高即很明顯。攜IL-8單抗的靶向造影劑的MCE檢查對(duì)于心肌缺血的敏感性和特異性均優(yōu)于常規(guī)超聲造影劑，優(yōu)于傳統(tǒng)二維超聲心動(dòng)圖，能更早期、更快速、更精準(zhǔn)地診斷出缺血性心臟病。

本實(shí)驗(yàn)研究在實(shí)際操作過程中尚存在某些不足，采用共價(jià)偶聯(lián)法制備的靶向超聲造影劑密度偏低，顯影強(qiáng)度不夠，可能與造影劑制備過程中操作手法不當(dāng)，相關(guān)技巧、工藝尚未完全成熟有關(guān)。

綜上所述，攜IL-8單抗靶向聲學(xué)造影劑與缺血心肌所釋放的炎性因子IL-8之間存在靶向作用，攜帶IL-8單抗靶向造影劑的MCE檢查對(duì)缺血心肌診斷更準(zhǔn)確，可早期定位診斷，是目前較為理想的檢查方法，有著廣闊的研究應(yīng)用前景，靶向性心肌聲學(xué)造影技術(shù)將為人類缺血性心臟病的診療開辟一個(gè)新途徑。