四君子湯血清藥效成分的HPLC-MS分析

尚如霞， 徐衛(wèi)東， 許曉倩， 彭云

(1. 鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

四君子湯組方為人參、白術(shù)、茯苓、甘草，其中，人參為君藥，有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力的功效；白術(shù)為臣藥，有健脾燥濕利尿功效；茯苓為佐藥，有抗腫瘤、滲濕健脾功效；甘草為使藥，甘緩和中，有抗病毒功效。四藥相輔，溫而不燥，補(bǔ)而不峻，共奏益氣健脾之功。其作為傳統(tǒng)的健脾基礎(chǔ)方，在肝干細(xì)胞的再生和肝細(xì)胞保護(hù)等方面起重要作用[1]，對(duì)肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的療效。但是，其對(duì)肝干細(xì)胞的作用機(jī)制目前尚未闡述清楚，組方發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)也不明確?；诖?，本文采用高效液相色譜-質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)，通過(guò)分析四君子湯水煎液和含藥血清中的化學(xué)成分，探討其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量260～300 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：201723805)。藥品均購(gòu)買自鎮(zhèn)江市老存仁堂藥店：白參片，產(chǎn)地吉林，批號(hào)170908，靖江市白山參茸有限公司；茯苓，產(chǎn)地安徽，批號(hào)180101，亳州吉貝爾中藥飲片有限公司；炙甘草，產(chǎn)地甘肅，批號(hào)171128，江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司；白術(shù)，產(chǎn)地安徽，批號(hào)171201，安徽黃太中藥飲片科技有限公司。乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia公司)。超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；超速離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀配備電噴霧離子源(ESI，美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 四君子湯水煎液的制備

按四君子湯處方中藥物的比例，取人參、白術(shù)、茯苓各9 g，炙甘草6 g，置于500 mL燒杯內(nèi)，加10倍質(zhì)量的水浸泡0.5 h；將燒杯放入加熱套中，煮沸，再煎煮1 h；過(guò)濾，分離濾液和殘?jiān)粴堅(jiān)铀?倍，煮沸后再煎煮1 h；過(guò)濾得濾液和殘?jiān)?；再將殘?jiān)铀蠓? h，過(guò)濾得濾液；將3次濾液合并，置于燒杯；將燒杯置于加熱套內(nèi)濃縮藥液至0.125 g/mL。放置4 ℃保存。

1.3 含藥血清的制備

將6只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組(n=4)和對(duì)照組(n=2)。實(shí)驗(yàn)組用濃縮好的四君子湯水煎液，按1 mL/100 g劑量(為臨床成人劑量的10倍)灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；對(duì)照組采用蒸餾水灌胃。在采血前禁食不禁水12 h以上，末次給藥后2 h，用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.1 mL/100 g；麻醉后采用頸動(dòng)脈插管于心臟取血(不抗凝)，靜置30 min，3 000 r/min室溫離心10 min；取上層血清，以0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行血清除菌，做好標(biāo)記，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

取含藥血清約4 mL，加入20 mL甲醇快速混勻震蕩，密閉超聲提取15 min；3 500 r/min室溫離心10 min；取上清液后放入坩堝里加熱濃縮，蒸干后加入1 mL甲醇溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析。

對(duì)照組血清用于質(zhì)譜分析時(shí)作為空白對(duì)照，排除空白血清的干擾。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件 Betasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：高純水，B:乙腈；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量2 μL；柱溫：35 ℃；樣品室溫：4 ℃；梯度洗脫條件如表1所示。

1.5.2 質(zhì)譜條件 ESI；噴霧電壓：3.5 kV；負(fù)離子檢測(cè)；鞘氣(N2)流速：80 arb；輔助氣(N2)流速:5 arb；毛細(xì)管溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：-30 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍(m/z)：100～1 200，碰撞氣體：氦氣；碰撞室能量：35 V；檢測(cè)波長(zhǎng)： 210、240、280 nm。

2 結(jié)果

2.1 四君子湯化學(xué)成分分析

根據(jù)HPLC-MS聯(lián)用掃描得到的質(zhì)譜圖(圖1、圖2)，查閱參考文獻(xiàn)[2-3]，推斷出四君子湯水煎液中含10種化學(xué)物質(zhì)，其中皂苷類7種，分別為人參皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黃酮類3種，分別為甘草苷、甘草素、甘草香豆素；其中人參皂苷Rb1、Re、Rg1、甘草酸為四君子湯的指標(biāo)性成分。因茯苓中的萜類和有機(jī)酸，白術(shù)中的內(nèi)酯類均不溶于水，故四君子湯水煎液中未能檢測(cè)到相關(guān)化合物。

推斷出四君子湯的含藥血清中含3種化學(xué)原型成分，分別為人參皂苷Rb1、Re、甘草酸；2種代謝產(chǎn)物分別為甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸。甘草次酸是由甘草酸水解脫去糖酸鏈所形成，甘草素葡萄糖醛酸亦為甘草酸水解后生成。見(jiàn)表2、3。

圖1 四君子湯水煎液總離子流圖

圖2 含藥血清的總離子流圖

序號(hào)保留時(shí)間(min)MrMS2成分推測(cè)168.26368367,309,297甘草香豆素298.78418417,255,135甘草苷3102.11256255,135甘草素4105.47801800,637,475人參皂苷Rg15107.85947945,783,637,474,390人參皂苷Re6120.161 1091 107,945,783,620,459人參皂苷Rb17127.211 0791 077,946,783,621,458人參皂苷Rb28136.55947946,783,621,459,375人參皂苷Rd9158.39822821,803,645,351甘草酸10160.68785783,620,458人參皂苷Rg3

表3 含藥血清化學(xué)成分分析數(shù)據(jù)

2.2 四君子湯血清原型化合物鑒定

在保留時(shí)間為87.69 min處，得到1 107.08 m/z的離子峰，查閱文獻(xiàn)[4]，人參中存在的人參皂苷Rb1分子式為C54H92O23，Mr為1 109.29，推測(cè)1107.08 [M-H]-m/z為其準(zhǔn)分子離子峰；對(duì)1 107.08 m/z行MS2分析，得到945.20，782.88，620.68，459.80 m/z等碎片峰；根據(jù)元素組成分析，推測(cè)該化合物為人參皂苷Rb1。見(jiàn)圖3。

圖3 含藥血清中人參皂苷Rb1的二級(jí)質(zhì)譜圖

在保留時(shí)間為74.43 min處，得到945.51 m/z的離子峰，查閱文獻(xiàn)[5]，人參中存在的人參皂苷Re分子式為C48H82O18，Mr為947.17，推測(cè)945.51 [M-H]-m/z為其準(zhǔn)分子離子峰；對(duì)945.51 m/z行MS2分析，得到798.78，636.88，474.40 m/z等碎片峰；根據(jù)元素組成分析，推測(cè)該化合物為人參皂苷Re。見(jiàn)圖4。

圖4 含藥血清中人參皂苷Re的二級(jí)質(zhì)譜圖

在保留時(shí)間為 126.34 min處，得到821.72 m/z的離子峰，查閱文獻(xiàn)[6]，甘草中存在的甘草酸分子式為C42H62O16，分子量為822.93，推測(cè)821.72 [M-H]-m/z為其準(zhǔn)分子離子峰，對(duì) 821.72 m/z行MS2分析，得到644.85，350.62 m/z等碎片峰；根據(jù)元素組成分析，推測(cè)該化合物為甘草酸。見(jiàn)圖5。

圖5 含藥血清中甘草酸的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 四君子湯血清代謝產(chǎn)物的鑒定

在保留時(shí)間為102.17 min處，得到469.50 m/z的離子峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，甘草代謝產(chǎn)物中含有甘草次酸，分子式為C30H46O4，Mr為470，推測(cè)469.50 m/z為其準(zhǔn)分子離子峰；對(duì)469.50 m/z行MS2分析，得到 423.47 m/z等碎片峰；根據(jù)元素組成分析，推測(cè)該化合物為甘草次酸。見(jiàn)圖6。甘草次酸是由甘草酸水解脫去糖酸鏈所形成。

在保留時(shí)間為61.53 min處，得到255.27 m/z的離子峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，甘草代謝物中存在甘草素葡萄糖醛酸，Mr為256，推測(cè)255.27 m/z為其準(zhǔn)分子離子峰；對(duì)255.27 m/z行MS2分析，得到237.36、195.28、135.12 m/z等碎片峰；根據(jù)元素組成分析，推測(cè)該化合物物為甘草素葡萄糖醛酸。見(jiàn)圖7。

圖6 含藥血清中甘草次酸的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 含藥血清中甘草素葡萄糖醛酸的二級(jí)質(zhì)譜圖

3 討論

根據(jù)HPLC-MS技術(shù)，對(duì)四君子湯水煎液及含藥血清進(jìn)行檢測(cè)，得到總離子流圖以及質(zhì)譜的碎片峰，推測(cè)出四君子湯水煎液中含有10種化學(xué)物質(zhì)，其中皂苷類7種，分別為人參皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黃酮類3種，分別為甘草苷、甘草素、甘草香豆素。人參皂苷Rb1、Re、Rg1以及甘草酸是藥典中規(guī)定人參及甘草中所必需有的化學(xué)成分，也是四君子湯中的4種指標(biāo)性成分。含藥血清中有人參皂苷Rb1、Re和甘草酸3種原型化學(xué)成分，以及甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸兩種代謝成分(均由甘草酸水解產(chǎn)生)。

本實(shí)驗(yàn)采用水提方法模擬傳統(tǒng)湯劑處方煎煮，由于茯苓中的萜類、有機(jī)酸類及白術(shù)中的內(nèi)酯類均不溶于水，故無(wú)法檢測(cè)到茯苓和白術(shù)中的相關(guān)化合物；同時(shí)說(shuō)明通過(guò)傳統(tǒng)的煎煮法，茯苓和白術(shù)的有效成分亦無(wú)法完全釋放出來(lái)。由此證實(shí)，四君子湯中的有效成分為人參及甘草，其中人參以原型化合物，而甘草則以水解產(chǎn)物的代謝形式存在于在血液中。