50例初診急性早幼粒細胞白血病患者6種PML/RARα異構體定量分析

韓蘭秀， 林江， 錢軍，*

(1. 江蘇大學附屬醫院檢驗科， 江蘇 鎮江 212001； 2. 江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室， 江蘇 鎮江 212002； 江蘇大學附屬人民醫院血液科， 江蘇 鎮江 212002)

絕大多數急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者具有特征性t (15;17) (q22;q12-21)，形成PML/RARα融合基因[1]。根據PML上斷裂位點的不同，該融合基因分為3種亞型，即長型(bcr1)、短型(bcr3)和變異型(bcr2)。我們的前期研究發現，長型和變異型患者體內還存在著P4R3重排(PML第5、第6外顯子缺失)、P46R3重排(PML第5外顯子缺失)[2]，與Pandolfi等[3]的報道一致。后者的研究還發現短型患者體內存在PML外顯子2和RARα外顯子3(P2R3)重排。然而有關這幾種異構體臨床意義的報道并不多，因此我們應用本課題組前期建立的6種特異性異構體實時定量PCR(RQ-PCR)檢測方法[4]，檢測了50例初診APL患者的cDNA標本，并結合臨床特征，分析其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 病例來源

APL初診患者50例，均來自我院血液內科的住院及門診病例，男23例，女27例，中位年齡為16歲。診斷符合血液病診斷及療效標準[5]。其中包括長型患者32例，變異型患者3例，短型患者15例。染色體核型分析均為t(15,17)。選取20例胸外科腫瘤患者肋骨中的骨髓標本作為正常對照。

1.2 骨髓單個核細胞分離、總RNA提取及逆轉錄

骨髓單個核細胞的分離使用Ficoll密度梯度離心法。按Trizol說明書一步法提取總RNA。紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度， RNA標本2.0 μg逆轉錄合成第一鏈cDNA。40 μL的逆轉錄體系中含200 U MMLV逆轉錄酶、dNTP、10 mmol/L DTT和25 U RNA酶抑制劑。37 ℃逆轉錄1 h、95 ℃滅活5 min得到cDNA標本。

1.3 RQ-PCR引物、探針的合成及陽性模板的制備

6種特異性異構體的上游引物由Primer 5.0軟件設計。bcr1/2的上游引物在PML外顯子5上，以便同時擴增長型和變異型異構體轉錄本[4]。用6種特異性異構體RQ-PCR體系擴增相應的APL患者cDNA標本，得到產物后進行純化、轉化、克隆，測序。確定測序結果正確后抽提質粒、比色定量、倍比稀釋，建立108～101拷貝/μL陽性模板濃度梯度。

1.4 RQ-PCR檢測患者cDNA標本中特異性異構體含量

RQ-PCR反應體系為25 μL，含2.5 μL緩沖液、4.0 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L引物、0.2 μmol/L探針、1.0 U Taq酶、0.5 μL 50×ROX 和50 ng cDNA。RQ-PCR反應條件為95℃ 5 min，94 ℃ 15 s、60℃ 1 min，45個循環。將所建立的標準曲線、正常對照、空白對照和患者的cDNA標本一起進行檢測。以ABL作為內參照，患者PML/RARα融合基因各種異構體的值都以相對量表示，即NPML/RARα= PML/RARα異構體的拷貝數/ABL拷貝數×100%。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學處理。符合正態性分布或近似正態分布時，兩組間均數比較選用t檢驗。不符合該條件時，用Mann-WhitneyU檢驗。相關性分析選用Spearman秩相關。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初診APL患者不同PML/RARα融合基因異構體的表達水平及患者的臨床特征

50例初診APL患者不同類型PML/RARα融合基因異構體的相對表達量及相關臨床參數見表1(由于bcr1和bcr2陽性患者均同時伴有P4R3和P46R3異構體，因此將之并為一組)。短型患者的白細胞總數顯著高于長型和變異型患者(P=0.036)，異構體bcr1/2的表達水平也明顯高于bcr3。而兩組患者的年齡、血紅蛋白含量等參數均無明顯差異(均P>0.05)。PML/RARα融合基因bcr1/2、bcr3、P4R3、P46R3及P2R3異構體的表達水平與患者的性別、年齡、外周血白細胞計數、血紅蛋白含量、血小板計數及骨髓異常早幼粒細胞比例均無相關性(均P>0.05)。異構體bcr1/2、P4R3和P46R3在所有長型和變異型患者體內都有表達，但表達水平無統計學意義(P=0.364)，特異性異構體bcr1/2及P4R3的表達含量均與P46R3相關(r=0.73，P<0.01；r=0.50，P=0.04)，但bcr1/2與P4R3的表達水平無相關性(r=0.34,P=0.063)。15例短型患者P2R3的表達水平明顯低于bcr3(P<0.01)，但無相關性(r=0.11,P=0.714)。

表1 初診APL患者臨床與分子生物學特性

2.2 危險度分級

根據文獻[6]對50例患者進行危險度分級，其中高危組(白細胞數>10×109/L)16例，中危組(白細胞數≤10×109/L；血小板計數≤40×109/L)17例，低危組(白細胞數≤10×109/L；血小板計數>40×109/L)17例。3組患者間5種融合基因異構體的表達水平無統計學差異。見表2。

表2 不同危險度患者間異構體相對表達量的比較 M(Q1，Q3)

2.3 患者隨訪分析

對其中32例患者的隨訪結果顯示，患者達到初次血液學完全緩解和分子生物學完全緩解時間與6種融合基因異構體含量無明顯相關性(均P>0.05)。

3 討論

由于全反式維甲酸、亞砷酸及傳統的蒽環類藥物為基礎的化療規范化應用，APL的預后得到極大改觀。但仍有約10%患者會復發[7]。PML/RARα融合基因在APL患者的診斷和微小殘留病的監測中至關重要，但大多研究僅針對bcr1、bcr2和bcr3這3種常見PML/RARα轉錄本[8-9]，對已發現多年的P4R3、P46R3和P2R3等異構體研究甚少[3]。本研究結果顯示，所有長型和變異型患者都同時表達bcr1/2、P4R3和P46R3，并且P46R3的表達水平均與bcr1/2和P4R3相關，但是相關意義仍不明確。另外我們發現幾種異構體的表達水平與患者性別、年齡及外周血細胞計數等臨床參數沒有相關性，可能與樣本量較少有關，需要進一步擴大樣本病例數以明確這幾種異構體的臨床意義。

以往認為P4R3和P2R3異構體編碼異常的截斷PML蛋白[3]，但我們認為這是長型和變異型PML/RARα融合基因的不同剪接異構體，即選擇性拼接。選擇性拼接是與轉錄和蛋白質多樣化有關的重要調控機制，影響了大約90%的人類基因組[10]。異常的選擇性拼接經常出現在癌癥和白血病中，但確切機制仍未明確[11-12]。既然幾種不同的選擇性拼接可以共存，那么既往用實時定量PCR方法檢測PML/RARα轉錄本的表達水平，所得結果是一種還是幾種異構體的共同表達？這樣是否會影響對真實結果的判斷？本研究獲得的是每個異構體的獨立表達水平，對于研究各異構體在APL發病、治療和預后等方面更加嚴謹。另外本研究還顯示，P4R3和P2R3異構體表達水平較低，都含有提前出現的終止密碼子(PTC)，且符合PTC規則[13]。因此，這兩種異構體可能觸發了無義介導的mRNA降解，從而參與PML/RARα融合基因水平的調節。

綜上所述，本研究初步分析了幾種異構體在初診APL患者中的臨床意義。但幾種異構體在APL發病、進展和復發中究竟發揮了怎樣的作用，還需進一步的探討。