rL-hIFN-λ1對THP-1源巨噬細胞極化作用的影響

張日婷， 張垚， 章安偉， 張烜烽， 嚴玉蘭

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬人民醫院呼吸內科， 江蘇 鎮江 212001)

巨噬細胞是一類由血液中單核細胞分化而來, 具有很強可塑性和多功能性的固有免疫細胞[1]，當體內外微環境發生變化時，可分化為具有不同表型和功能的巨噬細胞，此過程稱為巨噬細胞極化[2]。巨噬細胞可通過經典活化途徑極化成M1型巨噬細胞，或是進入替代極化途徑成為M2型巨噬細胞。

新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)是一種對人類無致病性的溶瘤病毒[3]，可參與多種免疫效應[4-5]。本課題組前期研究發現，表達IFN-λ1的重組新城疫病毒(recombinant NDV expressing human IFN-lambda1, rL-hIFN-λ1)可更強地抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡(如肺癌)，同時可促進外周血單核細胞產生較高水平Th1細胞因子及抑制Th2細胞因子產生[3，6]；但rL-hIFN-λ1在抑制肺癌發展過程中的具體免疫機制尚不清楚。本研究旨在探討rL-hIFN-λ1誘導巨噬細胞極化進而調控外周免疫應答實現抑制肺癌的機制，并分析不同臨床分期肺癌組織及惡性胸腔積液中巨噬細胞浸潤表型特點。

1 材料與方法

1.1 材料

人外周血THP-1單核細胞系購自美國模式培養物保藏所 (ATCC; Rockville, MD, USA)；rL-hIFN-λ1由本實驗組成員于中國農業科學院哈爾濱研究所重組[6]。臨床肺癌組織標本及胸腔積液標本取自2017年1月至2018年1月于江蘇大學附屬人民醫院胸外科行手術切除的18例肺癌患者。 所有標本均經病理檢查確診為肺腺癌。按照國際抗癌聯盟2017年肺癌TNM 分期標準進行分期，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各6 例。RPMI 1640培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、脂多糖(LPS)、佛波酯、Triton X-100、4%低聚甲醛(美國Sigma公司)；CO2恒溫培養箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；IFN-γ、IL-4(美國Peprotech公司)；CD86兔抗鼠單克隆抗體、CD163兔抗鼠單克隆抗體(美國CST公司)；Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG、Cy3標記兔抗羊 IgG (美國KPL公司)；IL-2、IL-13、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；Trizol(北京鼎國生物技術有限責任公司)；SYBR Premix ExTaq試劑盒(日本TaKaRa公司)；CD86、CD163及內參基因 GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；紫外-可見分光光度計(Beckman Du730，美國)；CFX96型實時定量PC儀，酶標儀(美國Bio-Rad公司)；臺式低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)。

1.2 細胞培養及誘導

THP-1細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素的RPMI 1640培養基培養，孵育于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中。

1.3 構建THP-1來源的M0、M1、M2巨噬細胞模型

參照文獻[7]報道的誘導方法將THP-1單核細胞系(3×105/mL) 鋪于6孔板中，每孔2 mL培養基，加入佛波酯150 ng/mL刺激24 h，誘導其成為M0型巨噬細胞(未激活型)；在M0基礎上更換培養基，加入LPS(10 pg/mL)、IFN-γ(20 ng/mL)刺激24 h，誘導得到M1型巨噬細胞(經典途徑激活型)；向M0加入IL-4(20ng /mL)刺激24 h，誘導得到M2型巨噬細胞(替代途徑激活型)，倒置相差顯微鏡觀察3組巨噬細胞形態。

1.4 免疫熒光檢測rL-hIFN-λ1誘導巨噬細胞極化

用MOI=1.0的rL-hIFN-λ1病毒懸液干預M0型巨噬細胞，將得到的rL-hIFN-λ1-M0型巨噬細胞與M0、M1以及M2 4組巨噬細胞分別接種于免疫熒光專用培養皿，PBS洗3次×5 min/次；4%低聚甲醛4 ℃固定24 h；PBS 洗3次×5 min/次；0.1% Triton X-100 37 ℃恒溫通透30 min；PBS洗3 次×5 min/次；3% BSA 37 ℃ 封閉30 min。棄封閉液，加入兔抗CD86 抗體(1 ∶200) 、山羊抗CD163抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；37 ℃復溫30 min，PBS洗3次×5 min/次；加入Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG (1 ∶800)、Cy3標記兔抗羊 IgG (1 ∶800)，37 ℃孵育1 h；PBS洗 3次×5 min/次，核熒光染料Hoechst 33342染色細胞核；隨后加入防熒光淬滅封片劑，在熒光顯微鏡下以波長569 nm激光激發紅色熒光，以波長488 nm激發綠色熒光，并觀察。陽性細胞計數方法：隨機選取9個視野，然后進行3 次單獨重復實驗，將視野中所有細胞納入統計計算結果。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測巨噬細胞表型

離心收集上述各組巨噬細胞，Trizol 法提取各組巨噬細胞RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值和濃度。根據說明書將所提取的RNA反轉錄為cDNA，然后作為模板行實時定量PCR反應，以GADPH為內參，檢測各組巨噬細胞中CD86、CD163 mRNA表達。內參GAPDH上游引物：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；CD86上游引物：5′-TGCTCATCTATACACGGTTACC3′；下游引物：5′-TGCATAACACCATCATACTCGA-3′；CD163上游引物：5′-ATCAACCCTGCATCTTTAGACA-3′；下游引物：5′-CTTGTTGTCACATGTGATCCAG-3′。反應條件：95 ℃ 預變性10 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣品設3個復孔，重復3次，取均值。采用 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.6 ELISA檢測各型巨噬細胞分泌的細胞因子

收集各組巨噬細胞上清液，分別命名為CM-M0、CM-M1、CM-M2、CM-rL-hIFN-λ1，1 000 r/min 離心5 min，取上清液。按照人源 IL-2、IL-13、 IL-10及 TNF-α ELISA 試劑盒說明書操作，測定各組上清液450 nm波長處D值，繪制標準曲線并計算上述上清液中各種細胞因子濃度。每組樣本設3個復孔，實驗重復 3 次。

1.7 免疫組織化學法檢測肺癌組織及胸腔積液中巨噬細胞表型

收集各組不同臨床分期肺癌組織及胸腔積液，胸腔積液予2 500 r/min離心5 min，棄上清液；標本加入4%低聚甲醛固定、脫水、透明，常規石蠟包埋，制成4 μm切片；石蠟切片經二甲苯透明10 min，梯度乙醇脫水。3% H2O2室溫孵育10 min，5% BSA室溫孵育20 min。分別滴加兔抗CD86 抗體(1 ∶200)、山羊抗CD163(1 ∶200)，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜。次日滴加山羊抗兔IgG-HRP和兔抗山羊IgG-HRP抗體(均1 ∶1 000) ，室溫孵育30 min。PBS沖洗，DAB顯色劑染色，蘇木素復染2 min，脫水，樹膠封片，鏡檢。使用Image-Pro Plus 6.0掃描肺癌組織及胸腔積液中CD86、CD163平均光密度。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 THP-1來源各型巨噬細胞形態

THP-1誘導分化而來的THP-1-M0型巨噬細胞由懸浮生長轉變成貼壁生長，細胞大小均一，分布均勻，呈規則圓形；LPS/IFN-γ誘導分化的THP-1-M1型巨噬細胞形態多樣，廣泛聚集貼壁生長，伸出偽足，呈長梭形；IL-4誘導細胞分化為THP-1-M2 細胞，同樣呈聚集貼壁生長趨勢，部分伸出偽足，但長梭形細胞相對較少。3組巨噬細胞形態之間存在差異，提示THP-1經不同刺激物誘導后可朝向不同類型巨噬細胞極化。見圖1。

圖1 M0、M1、M2型巨噬細胞形態(相差顯微鏡×400)

2.2 M1型巨噬細胞高表達CD86 mRNA, M2型巨噬細胞高表達CD163 mRNA

qRT-PCR結果顯示，與THP-1-M0相比，THP-1-M1高表達M1型巨噬細胞表型特異標志物CD86 mRNA(t=10.51，P<0.01)，THP-1-M2高表達M2型巨噬細胞表型特異性標志物CD163 mRNA (t=3.44，P<0.05)。綜上，LPS/IFN-γ和IL-4可分別有效誘導THP-1-M0巨噬細胞成功分化為M1和M2型巨噬細胞。見圖2。

a: P<0.01，b: P<0.05

2.3 rL-hIFN-λ1促進THP-1-M0巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化

由圖3可見，與THP-1-M0相比，rL-hIFN-λ1誘導得到的巨噬細胞高表達M1標志物CD86 mRNA(t=4.58，P<0.05)，而低表達M2標志物mRNA(t=2.96，P<0.05)，提示rL-hIFN-λ1可促進THP-1-M0巨噬細胞向M1型巨噬細胞而非M2型巨噬細胞極化。免疫熒光結果顯示，THP-1-M1型巨噬細胞CD86陽性率明顯高于THP-1-M2型巨噬細胞，而CD163陽性率低于THP-1-M2組。同時rL-hIFN-λ1極化的巨噬細胞的CD86陽性率同樣高于CD163，進一步證實rL-hIFN-λ1可以促進THP-1 M0巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化。見圖4。

圖3 qRT-PCR檢測rL-hIFN-λ1組巨噬細胞相關mRNA的表達

2.4 各型巨噬細胞炎癥因子分泌

ELISA檢測結果顯示，與THP-1-M0組相比，THP-1-M2組巨噬細胞上清液中IL-10和IL-13表達明顯增加(t=5.80，8.45，P均<0.01)，TNF-α和IL-2表達明顯減少(t=3.67，12.92，P均<0.05)，而THP-1-M1組巨噬細胞上清液則與之相反。同時，與THP-1-M0組相比，THP-1-rL-hIFN-λ1組上清液中TNF-α和IL-2明顯升高(t=24.74，7.14，P均<0.01)，而IL-10和IL-13表達明顯降低(t=3.46，19.05，P均<0.05)。見表1。

圖4 各組巨噬細胞CD86及CD163水平比較

組別IL-2IL-10IL-13TNF-αTHP-1-M051.21±9.1558.14±6.96132.77±19.2541.73±4.34THP-1-M190.13±12.20a42.31±6.13b56.95±13.96a227.88±24.59aTHP-1-M229.31±8.49b77.21±14.89a173.07±11.28a31.02±6.66bTHP-1-rL-hIFN-λ174.64±5.22a44.56±4.93b51.73±6.60b218.15±19.64aF值9.489.306.9842.72P值<0.01<0.01<0.05<0.01

a：P<0.01，b:P<0.05,與THP-1-M0組比較

2.5 肺癌組織及胸腔積液中相關蛋白的表達

免疫組化結果顯示，臨床Ⅰ期肺癌組織中CD86表達明顯多于Ⅱ、Ⅲ期肺癌組織(t=4.53，6.82，P均<0.01)，而CD163表達則明顯低于臨床Ⅱ、Ⅲ期肺癌組織(t=3.88，6.39，P均<0.01)；同時癌性胸腔積液中CD86表達較CD163表達少(t=11.19，P<0.01)。由此提示，肺癌的臨床分期進展與M1型巨噬細胞浸潤程度呈負相關。見圖5。

圖5 不同臨床分期肺癌組織和胸腔積液中CD86和CD163蛋白的表達( SP染色×200 )

3 討論

巨噬細胞在腫瘤進展中發揮重要的作用，在外界不同的刺激下可分別向抑制腫瘤生長的M1型巨噬細胞和促進腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移、抑制適應性免疫應答的M2型巨噬細胞極化[8]。本實驗利用THP-1人源外周血單核淋巴細胞構建巨噬細胞模型，經從形態到表面分子以及分泌的細胞因子的檢測，證實LPS/IFN-γ 和IL-4可以分別誘導THP-1-M0型巨噬細胞向M1、M2型巨噬細胞極化，證實巨噬細胞具有很強的可塑性。

研究發現，促進M1型巨噬細胞極化可有效抑制腫瘤進展。rL-hIFN-λ1是可穩定表達IFN-λ1的新城疫病毒，其受體廣泛存在于CD4+T、PBMCs及NK細胞，與受體結合可發揮類似IFN-γ的作用，促進人源巨噬細胞分泌IL-12 p40調動機體免疫應答[9-11]，故我們推測rL-hIFN-λ1的抗腫瘤效應可能與其能夠促進M0型巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化密切相關。本研究結果顯示，rL-hIFN-λ1能發揮類似LPS/IFN-γ的作用，誘導THP-1-M0型巨噬細胞高表達M1型巨噬細胞標志物CD86 mRNA，并且釋放M1型巨噬細胞因子,如IL-2、TNF-α，同時抑制M2型巨噬細胞標志物CD163 mRNA的表達和抑制M2型巨噬細胞因子IL-13、 IL-10的釋放，提示 rL-hIFN-λ1具有促進M0巨噬細胞向 M1 極化，抑制其向 M2極化的能力。

浸潤到腫瘤基質中的巨噬細胞主要以M2型為主，又被稱作腫瘤相關巨噬細胞，且與腫瘤的良好預后呈負相關，而 M1型巨噬細胞數量與良好預后呈正相關[8,12]。本研究免疫組化結果顯示，臨床Ⅰ期肺腺癌組織中浸潤的巨噬細胞以M1型為主，而臨床Ⅱ期、Ⅲ期肺腺癌組織中以M2型巨噬細胞浸潤為主，且惡性胸腔積液中也以M2型巨噬細胞浸潤為主，與上述文獻報道一致。由此提示巨噬細胞表型與肺腺癌臨床分期及腫瘤惡性生物學行為密切相關，巨噬細胞的極化狀態可作為判斷肺腺癌患者臨床預后的參考指標，但巨噬細胞浸潤表型特點與其他病理類型肺癌臨床預后之間的相關性有待進一步探討。

綜上所述，肺癌臨床發展進程與巨噬細胞浸潤表型密切相關，rL-hIFN-λ1可促進THP-1源巨噬細胞向M1極化。巨噬細胞高度的異質性和可塑性決定了M1型巨噬細胞不僅可由M0型巨噬細胞極化而來，也可以由M2型巨噬細胞極化而來[13]。因此我們推測rL-hIFN-λ1 不僅可以促進M0型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉化，還可能誘導M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉化，從而減少促腫瘤發生發展的M2型比例，但具體機制仍有待進一步研究證實。