利福平通過(guò)促進(jìn)自噬保護(hù)帕金森病模型細(xì)胞損傷

王春燕， 馮凡，， 鞏企霞， 束瑜， 萬(wàn)晟霞， 趙晶， 徐平， 錢進(jìn)軍

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

帕金森病最重要的病理性標(biāo)志為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失，在殘存的神經(jīng)元內(nèi)可見(jiàn)聚集的路易小體及α-突觸核蛋白(α-syn)多聚體，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺水平的下降。對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元丟失的具體機(jī)制尚未十分清楚，但目前認(rèn)為α-syn多聚體含量的增高或蛋白過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致帕金森病，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集(如α-syn)[1]成為帕金森病發(fā)病機(jī)制的核心假說(shuō)。過(guò)表達(dá)或者聚集的α-syn蛋白可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，造成線粒體功能障礙[2]及氧化應(yīng)激[3]等損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。自噬途徑在參與蛋白質(zhì)寡聚體及多聚體降解的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。帕金森病患者自噬功能受損[5-6]，導(dǎo)致溶酶體介導(dǎo)的α-syn多聚體的清除水平降低。利福平是一種半合成廣譜抗生素，具有神經(jīng)保護(hù)作用。在魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中，利福平可減少多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)α-syn及其多聚體的含量[7]。利福平是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬以增加α-syn多聚體的清除，從而降低神經(jīng)元的凋亡率？基于此，本課題小組展開(kāi)以下實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞系和主要儀器

人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營(yíng)養(yǎng)所惠贈(zèng)；DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亞砜、魚藤酮、利福平、雷帕霉素、氯喹和MTT(美國(guó)Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(美國(guó)BD公司)；兔抗人α-syn(美國(guó)Abcam公司)；兔抗人Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、β-肌動(dòng)蛋白及HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(美國(guó)Proteintech公司)。

FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；Ti-S倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SH-SY5細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合液的DMEM-F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液1次。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，將其消化并以1∶3比例傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞活力

1.3.1 選取魚藤酮有效濃度 將細(xì)胞以1×105密度接種于96孔板，每孔100 μL，孵育24 h；棄上清液，每孔分別加入0、5、10、25 μmol/L魚藤酮溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h；棄上層液體，每孔加入100 μL 二甲基亞砜，搖勻直至紫色化合物全部溶解；酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度(D)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(給藥組D值/空白對(duì)照組D值)×100%。所有給藥組每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.3.2 選取利福平最佳濃度 按“1.3.1”中方法接種細(xì)胞，加入5 μmol/L魚藤酮作用于細(xì)胞24 h；棄上清液，再分別加入0、50、150、300 μmol/L利福平繼續(xù)處理細(xì)胞24 h；按照上述MTT法測(cè)定各組細(xì)胞光密度(D)值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 選取雷帕霉素和氯喹最佳濃度 按上述“1.3.1”中方法接種細(xì)胞，分別將10、100、1 000 nmol/L雷帕霉素和1、10、100 μmol/L氯喹單獨(dú)作用于SH-SY5細(xì)胞，孵育2 h；MTT法測(cè)定各組D值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將細(xì)胞分為4組。對(duì)照組：不加任何藥物；魚藤酮組：用5 μmol/L魚藤酮處理細(xì)胞，24 h后棄上清液，改為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；利福平+魚藤酮組：5 μmol/L魚藤酮處理細(xì)胞24 h，棄上清液，再用150 μmol/L利福平處理細(xì)胞24 h；利福平組：用150 μmol/L利福平單獨(dú)處理細(xì)胞24 h。提取各組細(xì)胞蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/Ⅰ水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取“1.4”中分組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，各組樣品加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI染色試劑，輕輕混勻后避光、室溫反應(yīng)10 min；加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。每組重復(fù)3次。

1.6 雷帕霉素和氯喹最佳作用時(shí)間篩選

選取10 nmol/L雷帕霉素和10 μmol/L氯喹，分別作用于“1.2”中細(xì)胞0.5、1、2 h，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Beclin-1的表達(dá)水平。

將雷帕霉素(10 nmol/L，2 h)、氯喹(10 μmol/L，1 h)分別作用于“1.4”分組中的魚藤酮組和利福平+魚藤酮組細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)α-syn多聚體表達(dá)水平。

將0、0.2、1、5 μmol/L魚藤酮分別作用于“1.2”中的細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-syn多聚體及Beclin-1表達(dá)水平。

將魚藤酮(5 μmol/L，24 h)、氯喹(10 μmol/L，1 h)、雷帕霉素(10 nmol/L，2 h)分別作用于“1.2”中細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-syn多聚體及Beclin-1表達(dá)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)α-syn多聚體水平和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

提取蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)蛋白濃度，制備濃縮膠和分離膠，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白適用12%分離膠，其余各蛋白均適用10%分離膠。將等量的各蛋白樣本(約80 μg)分別上樣，行SDS-PAGE；濕法電轉(zhuǎn)膜(250 mA，40 min)；將PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；用1×TBST洗膜3次，5 min/次；加入α-syn、Beclin-1、p62、LC3、β-肌動(dòng)蛋白抗體(稀釋比均為1 ∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加入二抗(稀釋比均為1 ∶6 000)室溫孵育1.5 h；洗膜后在暗室中加入ECL曝光液，經(jīng)成像系統(tǒng)顯影。采用Image J軟件處理圖像，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的條帶與內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白的光密度比值。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各藥物的最佳作用條件

2.1.1 魚藤酮有效濃度與利福平最佳濃度的確定 與對(duì)照組相比，5、10、25 μmol/L魚藤酮處理組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低(P均<0.01)，綜合考慮選取5 μmol/L魚藤酮為起始有效濃度。與魚藤酮組相比，50、150、300 μmol/L利福平組細(xì)胞存活率均有增高趨勢(shì)，但150 μmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.0，P<0.01)，故選擇150 μmol/L利福平作為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)不同濃度魚藤酮和利福平處理24 h后的細(xì)胞存活率

2.1.2 自噬調(diào)節(jié)劑雷帕霉素和氯喹最佳濃度與時(shí)間的確定 與對(duì)照組相比，10 nmol/L雷帕霉素和10 μmol/L氯喹細(xì)胞存活率不受影響(雷帕霉素：t=1.27，氯喹：t=2.72，P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氯喹1 h組Beclin-1表達(dá)水平明顯降低(t=18.84，P<0.01)，雷帕霉素2 h組Beclin-1表達(dá)水平明顯提高(t=25.78，P<0.01)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用雷帕霉素10 nmol/L作用2 h，氯喹10 μmol/L作用1 h作為自噬促進(jìn)劑雷帕霉素和自噬抑制劑氯喹預(yù)處理的最佳濃度和時(shí)間。見(jiàn)圖3。

圖2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率

2.2 自噬受抑制時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-syn多聚體含量增加

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度魚藤酮組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Beclin-1表達(dá)明顯減少(P均<0.01)，且魚藤酮對(duì)Beclin-1和α-syn多聚體含量的影響呈濃度依賴性，較高濃度魚藤酮(5 μmol/L)使SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Beclin-1表達(dá)明顯減少(t=27.04，P<0.01)，α-syn多聚體表達(dá)明顯增加(t=13.81，P<0.01)。 與對(duì)照組相比，氯喹組Beclin-1表達(dá)明顯減少(t=4.08，P<0.05)，α-syn蛋白多聚體含量顯著升高(t=12.82，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Beclin-1蛋白的表達(dá)

a：P<0.01，b：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.3 利福平降低帕金森病模型細(xì)胞的凋亡率

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，魚藤酮組凋亡率明顯升高(t=10.0，P<0.05)；與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組凋亡率降低(t=7.81，P<0.05)。見(jiàn)圖5。

2.4 利福平降低帕金森病細(xì)胞模型α-syn多聚體的含量

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，魚藤酮組α-syn多聚體含量明顯上升(t=4.66，P<0.01)；與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組α-syn多聚體含量顯著降低(t=11.35，P<0.01)。見(jiàn)圖6。

2.5 利福平通過(guò)促進(jìn)自噬降低α-syn多聚體水平

蛋白印跡結(jié)果顯示，與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組Beclin-1表達(dá)顯著升高，p62表達(dá)顯著下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ提高(Beclin-1：t=22.33，p62：t=9.17，LC3-Ⅱ/Ⅰ：t=12.4，P均<0.01)。與利福平+魚藤酮組相比，氯喹預(yù)處理組α-syn多聚體表達(dá)水平明顯增加(t=30.15，P<0.01)。見(jiàn)圖7。

b：P<0.05

a：P<0.01

3 討論

帕金森病的主要發(fā)病機(jī)制包括α-syn異常沉積、氧化應(yīng)激、自噬損傷、免疫異常、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[8]，其中α-syn異常沉積、氧化應(yīng)激等均可在不同層面導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。神經(jīng)退行性疾病在自噬的不同階段受損，可以通過(guò)多種方式觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。當(dāng)自噬體清除和底物降解步驟受損時(shí)，噬溶酶體會(huì)積累突變體和氧化蛋白、蛋白質(zhì)寡聚體及蛋白質(zhì)多聚體、受損的細(xì)胞器和其他未完全消化的產(chǎn)物，從而增加溶酶體膜的通透性，導(dǎo)致水解酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中。溶酶體組織蛋白酶釋放可通過(guò)線粒體釋放的細(xì)胞色素c激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

大多數(shù)情況下，自噬促進(jìn)細(xì)胞生存，意味著自噬傾向于抗細(xì)胞凋亡。通常在低劑量損傷時(shí)，自噬的細(xì)胞保護(hù)功能優(yōu)于其潛在的細(xì)胞毒性作用[10]。研究顯示，在帕金森病大鼠模型和PC12細(xì)胞中[11]，魚藤酮能夠誘導(dǎo)自噬底物p62和α-syn聚集，損傷溶酶體膜的完整性，擾亂自噬流，促進(jìn)細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度魚藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，p62和α-syn多聚體水平升高，證實(shí)了魚藤酮對(duì)細(xì)胞自噬的損害，說(shuō)明在多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)退行性病變過(guò)程中自噬功能受抑制，干擾了α-syn蛋白多聚體的降解。

在脂多糖誘導(dǎo)的帕金森病炎癥損傷模型中[12]，利福平通過(guò)抑制TLR-4通路減少促炎因子的釋放最終減少細(xì)胞凋亡。

利福平通過(guò)減少活性氧釋放，避免線粒體損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，亦可降低神經(jīng)元凋亡率[13]。本實(shí)驗(yàn)采用魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型，當(dāng)利福平為150 μmol/L時(shí)，不僅能最大限度促進(jìn)細(xì)胞生存，還能有效減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在阿爾茲海默癥動(dòng)物模型中[14]，17月齡APPOSK小鼠每天口服利福平0.5 mg，1個(gè)月后β-淀粉樣蛋白的積累明顯減少；13月齡Tg2576小鼠每日口服利福平0.5 mg，1個(gè)月后，利福平以劑量依賴性方式減少α-淀粉樣蛋白寡聚體積累和tau過(guò)度磷酸化，減少突觸喪失以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活化。本研究中利福平有效降低了魚藤酮組α-syn多聚體水平，由此推測(cè)，利福平可能在阿爾茲海默癥動(dòng)物模型和帕金森病細(xì)胞模型中通過(guò)減少病理蛋白的積累，發(fā)揮抑制神經(jīng)元凋亡的作用。

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)α-syn多聚體及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

在帕金森病炎癥細(xì)胞模型中，與未預(yù)處理的細(xì)胞相比，利福平預(yù)處理的BV2細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)明顯增高，溶酶體與線粒體共定位增加，表明利福平可通過(guò)自噬途徑發(fā)揮抗炎作用[15]。本研究結(jié)果顯示，利福平可有效提高Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，減少自噬底物p62和α-syn多聚體表達(dá)，且自噬抑制劑氯喹部分消除了利福平預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用，提示利福平可能通過(guò)促進(jìn)自噬加強(qiáng)α-syn蛋白多聚體的清除，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，最終減少神經(jīng)元凋亡。

對(duì)于利福平神經(jīng)保護(hù)作用的研究，本課題小組目前局限于細(xì)胞層面，未能很好地展現(xiàn)藥物在生物體內(nèi)復(fù)雜的代謝反應(yīng)，下一步擬進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和研究。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的反應(yīng)過(guò)程，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，擬使用透射電鏡、免疫熒光分析等技術(shù)全方位捕捉自噬流的變化，研究利福平在自噬泡形成的起始、延伸、融合等過(guò)程中的表現(xiàn)及其與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究初步證實(shí)在帕金森病細(xì)胞模型中，利福平能減少魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡，且可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬降低α-syn多聚體水平。