低鋅飲食對大鼠二次打擊驚厥模型遠期驚厥閾和鋅轉運體3的影響

陳妮娜， 倪宏

(蘇州大學兒科臨床研究院， 江蘇 蘇州 215000)

癲癇是大腦神經元突發性的異常放電，導致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病，其特征為反復發作、自發發作。鋅是體內數百種酶和其他蛋白質的重要輔助因子，參與細胞分化、增殖、凋亡等過程[1]。鋅在腦內的分布不均衡，在前腦某些特定的部位濃度最高，如海馬、杏仁核和皮層[2-3]。腦內約90%的鋅與金屬硫蛋白結合，另外約10%的游離鋅存在于突觸前囊泡中，在信號傳導過程中發揮重要作用。癲癇的發作與鋅在體內的代謝異常密切相關，有學者認為癲癇患者血液或者腦脊液中的鋅含量增高[4-5]，但也有學者報告是降低的[6-7]。因此，研究鋅代謝異常在癲癇的發作機制中具有重要意義。

鋅轉運蛋白(ZnTs)家族有10個成員，能夠促進細胞質鋅的外流以及使鋅在各細胞器內區室化改變，從而降低細胞質鋅的含量，對鋅穩態的維持至關重要[8]。ZnT3表達在含鋅神經元的突觸小泡膜上，并將鋅離子轉運到突觸小泡內。ZnT3表達量變化直接影響突觸小泡游離鋅離子的濃度。本實驗通過腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品制備大鼠癲癇持續狀態模型，以低鋅飲食喂養2周，觀察大鼠二次打擊驚厥閾及死亡率，檢測大鼠大腦皮層ZnT3表達量，以探討低鋅飲食對大鼠二次打擊驚厥模型遠期驚厥閾、死亡率和ZnT3的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只27日齡(P27)健康SD大鼠，雄性，體重80～100 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物許可證號：SCXK(蘇)2018—0006。在室溫25 ℃，濕度45%環境喂養，每日12 h光照，自由進食和飲用去離子水。

1.2 主要藥品和試劑

氯化鋰(美國Sigma公司)，實驗時取127 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。匹羅卡品(美國Sigma公司)，實驗時取320 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。氫溴酸東莨菪堿(Scopolamine hydrobromide,蘇州氬氪氙貿易有限公司)，實驗時取1 mg溶于10 mL生理鹽水中備用。青霉素(華北制藥有限公司)；ZnT3兔多克隆抗體(1 ∶1 000,Synaptic Systems公司)；羊抗兔IgG(聯科生物科技公司)；鋅測定試劑盒(世紀沃德生物科技公司)。

1.3 大鼠驚厥持續狀態模型的建立

用于制備驚厥模型的雄性成年SD大鼠40只，于P27腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，24 h后即P28腹腔注射氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)，以減少外周膽堿能反應，30 min后腹腔注射匹羅卡品(320 mg/kg)誘導癲癇發作。按照Racine分級[9]，將大鼠行為分為Ⅰ-Ⅴ級，若給藥后大鼠癇性發作未到達Ⅳ級，則視為誘導失敗。

1.4 動物分組與飲食干預

將60只P27健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組，其中對照組和低鋅飲食組各10只，驚厥組和驚厥低鋅飲食組共有備用大鼠40只，制備癲癇持續狀態模型成功的大鼠隨機分配到2組中。前2天(即P27、P28)各組均予常鋅飲食(鋅44 mg/kg)喂養，致驚厥后對照組和驚厥組繼續予常鋅飲食喂養，低鋅飲食組和驚厥低鋅飲食組予低鋅飲食(鋅 2.7 mg/kg)喂養。喂養2周后予青霉素(劑量為每天5.1×106U/kg)二次打擊，記錄青霉素注射后大鼠首次出現驚厥發作的時間(驚厥閾)、死亡時間及死亡率，觀察時間為1 h。觀察結束后取腦組織，冰上迅速分離大腦皮層，裝進已標記的EP管中，放入-80 ℃冰箱凍存。

1.5 體重及血清鋅濃度檢測

制備驚厥模型后，各組大鼠隔日稱體重。2周后各組大鼠麻醉后心臟采血, 3 000 r/min離心10 min后取上清液于已標記的EP管中。按鋅測定試劑盒說明書，取12 μL樣品(血清、鋅標準液及去離子水作為空白)，加入200 μL的試劑一37℃水浴5 min，于570 nm處讀取光密度D1；加入試劑二水浴5 min后讀取D2,△D=D2-D1。樣本濃度=(△D樣品/△D標準)×標準品濃度。

1.6 蛋白質印跡法檢測大腦皮層ZnT3蛋白表達

取各組大鼠大腦皮層組織，在冰上充分研磨后加入蛋白裂解液，在超聲細胞破碎儀中低溫勻漿，15 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清液。用蛋白質定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度，配平。制備10%的SDS-PAGE下層分離膠和5%的上層壓縮膠，上樣體積10 μL，電泳90 min分離ZnT3，100 V轉膜60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h。加兔多克隆一抗ZnT3(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG室溫下孵育1.5 h，最后加入ECL化學發光液，成像儀掃描結果。以Image J軟件計算各條帶的灰度值，以β-微管蛋白為內參，以ZnT3與β-微管蛋白灰度比值作為ZnT3蛋白相對表達量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 氯化鋰-匹羅卡品誘導驚厥發作的行為特點

驚厥組和驚厥低鋅飲食組大鼠于腹腔注射匹羅卡品后20～30 min即出現相應的外周膽堿能反應，主要表現為立毛、呆滯、流涎、結膜充血等，同時或者先后出現刻板動作，主要表現為面部抽搐、反復咀嚼、點頭動作、濕狗樣抖動，同時或者交替出現單側或者雙側的前肢陣攣，后期反復雙側前肢陣攣，大鼠出現直立行為，偶可見跌倒發生，部分大鼠以Racine Ⅳ級或Ⅴ級發作為首發表現。對照組和低鋅飲食組予生理鹽水代替氯化鋰、匹羅卡品腹腔注射，未出現以上發作行為。本實驗中達到Ⅳ級及以上發作的大鼠有29只，誘導成功率為72.5%(29/40)。誘導成功的老鼠中有4只因全身強直抽搐當場死亡，剩余25只隨機分入驚厥組和驚厥低鋅組，有3只在持續驚厥后第2天死亡，總死亡率為24.1%(7/29)。驚厥組及驚厥低鋅飲食組各隨機選出10只進行后續實驗，剩余2只大鼠備用。

2.2 4組大鼠不同日齡體重比較

驚厥前各組大鼠體重比較差異無統計學意義。驚厥第3天、5天、7天驚厥組、驚厥低鋅飲食組體重明顯低于對照組(P<0.05)；驚厥第9天驚厥低鋅飲食組體重明顯低于對照組(P<0.05)；驚厥第11天、13天、15天各組大鼠體重比較差異無統計學意義。見表1。表明驚厥急性期大鼠體重明顯降低，后逐步恢復增長。

2.3 血清鋅濃度比較

對照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠血清鋅濃度分別為(39.04±5.74)、(34.53±7.12)、(31.35±6.38)、(29.89±7.11)μmol/L，差異有統計學意義(F=3.755，P=0.019)。驚厥組和驚厥低鋅飲食組血清鋅濃度明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；低鋅飲食組與對照組、驚厥低鋅飲食組與驚厥組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。表明大鼠持續驚厥后2周血清鋅濃度明顯降低。

表1 各組大鼠不同日齡體重比較 g，n=10

a：P<0.05，與對照組比較

2.4 二次打擊后驚厥發作的行為特點及驚厥閾

2.4.1 二次打擊驚厥發作的行為特點 喂養第15天大鼠腹腔注射青霉素后約20 min陸續出現驚厥發作，表現為活動增多、咀嚼、節律性點頭、甩尾，單雙側的前肢陣攣、抽搐伴或不伴后肢直立，不協調爬行，嚴重者可出現全身強直—陣攣發作，四處竄逃并伴有尖叫，最后失去平衡而跌到，甚至死亡。結果顯示：各組大鼠二次打擊后均出現驚厥發作，驚厥發生率為100%。

2.4.2 驚厥閾比較 對照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠驚厥閾分別為(43.84±5.40)、(35.02±6.81)、(35.22±6.56)、(27.96±6.83)min，差異有統計學意義(F=10.222,P<0.05)。低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組驚厥閾明顯低于對照組(P<0.05)，驚厥低鋅飲食組明顯低于低鋅飲食組和驚厥組(P<0.05)。表明大鼠持續驚厥后2周再次受到打擊，易感性明顯增加；且低鋅飲食喂養2周亦可使二次打擊時的易感性增加，二者具有增強效應。

2.5 二次打擊后大鼠生存時間及生存率比較

對照組、低鋅飲食組、驚厥組、驚厥低鋅飲食組大鼠的生存時間分別為(57.50±1.73)、(52.06±3.22)、(46.98±4.25)、(36.29±3.89)min，見圖1。經log-rank法檢驗，驚厥低鋅飲食組生存時間明顯低于對照組和低鋅飲食組(χ2分別為9.994、6.707，P<0.05)；低鋅飲食組與對照組、驚厥低鋅飲食組與驚厥組相比，差異無統計學意義(χ2分別為1.204、2.812，P>0.05)。表明低鋅聯合驚厥處理能明顯減少二次打擊后的生存時間，二者互為增強作用。各組生存率分別為80%、60%、50%、20%，經Fisher精確檢驗，差異無統計學意義(P=0.073)。

圖1 各組大鼠二次打擊后生存時間比較

2.6 ZnT3在各組大鼠大腦皮層的表達

蛋白質印跡檢測結果顯示，各組大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達的總體差異有統計學意義(F=34.646，P<0.05)。低鋅飲食組明顯低于對照組(P<0.05)，驚厥低鋅飲食組明顯低于驚厥組(P<0.05)，表明低鋅飲食喂養2周可使大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達降低；驚厥組與對照組、驚厥低鋅飲食組與低鋅飲食組比較均明顯降低(P<0.05)，表明大鼠持續驚厥后2周可使大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達降低。見圖2。

1: 對照組； 2： 低鋅飲食組； 3： 驚厥組； 4： 驚厥低鋅飲食組。*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與驚厥組比較；△：P<0.05，與低鋅飲食組比較

圖2各組大鼠大腦皮層ZnT3蛋白表達

3 討論

鋅多分布于海馬的齒狀回苔蘚纖維突觸的囊泡中，在神經元活動時，釋放到突觸間隙，調節突觸傳遞。鋅不僅直接結合突觸后受體，還能進入突觸后神經元發揮多種生理功能。鋅能夠發揮抑制或促進神經元興奮性的作用，提示可能具有促驚厥和抗驚厥特性。ZnT3對鋅具有高度專一性，負責將鋅轉運至突觸囊泡中，再釋放入突觸間隙發揮調節功能[10]。

本實驗低鋅飼料喂養2周大鼠尚未出現明顯的缺鋅癥狀，如脫毛、脫皮、紅腫、食欲不振等，體重增長未出現明顯緩慢，血清鋅濃度亦未明顯降低。說明低鋅飼料喂養2周，大鼠尚處于代償期，體內血清鋅濃度仍較為穩定。驚厥后大鼠血清鋅濃度和驚厥閾明顯降低；驚厥聯合低鋅處理可明顯降低血清鋅濃度、驚厥閾及生存時間。表明缺鋅可增加癲癇發作的易感性。

鋅缺乏能增加神經損傷、促進神經元死亡，且可能是通過調節ZnT3的表達量而發揮作用。在海人酸誘導的癲癇模型中，通過原子光譜分析發現模型組動物海馬和大腦內其他區域的鋅離子減少[11]；ZnT3敲除小鼠比正常小鼠更容易受到紅藻氨酸誘導的癲癇發作[12]，且海馬苔蘚纖維鋅離子染色完全缺如；減少突觸鋅可能有助于神經元興奮過度，增加熱性驚厥的風險[13]。另有研究表明了矛盾的結果，在刺激前反復注射膜透性鋅螯合劑可降低點燃誘發的癲癇發作和后放電的持續時間[14]。鋅發揮保護作用可能需要一個合適的濃度范圍，超出這個范圍則發揮神經毒性作用。

本研究表明缺鋅能增加癲癇發作的易感性，這種現象可能是低鋅飲食通過下調ZnT3的表達，破壞大腦鋅穩態導致的。本實驗為癲癇發生與鋅的關系提供了新的切入點，但尚缺高鋅飲食干預來探究鋅的合適濃度范圍，仍需更多的研究來揭示鋅與癲癇之間的關系及相關的具體機制。