傳染性法氏囊病毒分子鑒定及序列分析

詹麗娥　陸冰洋　劉華棟　王彩先　唐娟　詹海杰　丁樹榮

摘要：傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal diseasevirus，IBDV）引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。本實驗從山西省不同地區疑似法氏囊病雞中分離到法氏囊病毒，經雞胚培養繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設計引物、cDNA的PCR擴增、電泳、測序。通過序列分析比對，最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

關鍵詞：法氏囊病毒；分子鑒定；VP2基因

雞傳染性法氏囊病（IBD）于1957年首次在美國東海岸特拉華州南部岡博羅城的肉雞群中發現，因此也稱“岡博羅”病，Wint-orfield于1962年從患病的小雞雞胚中分離出病毒，1972年定名為雞傳染性法氏囊病。80年代以后至90年代以來歐洲國家出現了致死率很高的超強毒傳染性法氏囊病病毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）。vvIBDV的流行特點及病原特性：對雞具有很強的致病性，雞對IBD最易感階段為3～6周齡，vvIBDV不僅能感染有較高母源抗體的3周齡以內的雛雞，而且也能引起大周齡雞發病；死亡率高；引起嚴重的法氏囊損傷是vvIBDV的又一顯著特點：病死雞的法氏囊顯著腫大，嚴重出血，有的外觀呈“紫葡萄”樣。幾十年來，已遍及幾乎所有養雞國家，給各國養雞業帶來巨大經濟損失。傳染性法氏囊病超強毒（IBDV）引起雞的免疫抑制，導致新城疫、馬立克氏、禽流感、傳染性支氣管炎和球蟲等病免疫失敗。近年來，山西省及全國一些地方由于超強毒株的流行，導致常用的傳統IBD弱毒疫苗和滅活疫苗不能提供足夠的保護，而造成免疫失敗，也使本病的流行出現了新的特點，從而更加重了對養禽業的危害。超強毒株能夠沖破高水平母源抗體，破壞常規疫苗的保護作用，不僅能造成體液免疫抑制，而且對細胞免疫也有一定影響。本實驗從山西省不同地區采集疑似法氏囊病雞病料，主要采集的法氏囊特征是腫大、表面充血、出血，呈“紫葡萄樣”；切開可見黏膜彌漫性出血，并有黏稠的奶酪樣物質覆蓋。經病料采集處理、病毒純化繁殖、電鏡觀察、提取RNA、設計引物、cDNA的PCR擴增、電泳、測序。通過序列分析比對，最后鑒定其為傳染性法氏囊病毒株。

1材料

1.1雞胚及雛雞

SPF蛋購自山東省家禽研究所，由本實驗室孵化室孵化至所需日齡雞胚。試驗雞購自山西某雞場；

1.2病料采集處理及病毒純化繁殖

1.2.1病料的采集處理從山西省不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料，用PBS緩沖液無菌研磨，反復離心3次，取上清液。保存備用。

1.2.2病毒純化繁殖SPF雞蛋60枚，分三批入孵，每批20枚。用常規的絨毛尿囊膜接種法，接種法氏囊病毒乳液，盲傳幾次，收獲絨毛尿囊膜和尿囊液備用。

1.3試劑及診斷液

主要試劑：DNA marker 2000為TIANGEN公司產品；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒為美國AXYGEN公司產品；PlasmidMinikitl（100）為OMEGA BIO-TEK公司產品；堿法質粒提取溶液Solution Ⅰ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ參照分子克隆實驗指南配制；IBDV陽性血清和抗原購自中國哈爾濱獸醫研究所。

1.4菌株及載體

大腸桿菌DH5 α由本實驗室保存；PfastBacHTA表達載體及相關產品購自Invitrogen；PMD18-T載體為寶生物工程（大連）有限公司產品；限制性內切酶EcoRI、Xhol購自NEB。

2方法

2.1病料采集處理及病毒純化繁殖

2.1.1病料的采集處理從山西省不同地區疑似法氏囊病雞中采集法氏囊病料。主要選擇法氏囊外觀水腫呈膠凍樣、出血呈紫葡萄狀。將病料反復凍融三次，充分釋放病毒粒子，增加病毒粒子含量，1：5生理鹽水無菌研磨，再等體積加入4，000IU/mL青霉素和2，000IU/mL鏈霉素的雙抗，放入-20℃保存，備用。用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線。

2.1.2病毒純化繁殖取60枚SPF雞蛋，分三批入孵，每批20枚。將第一批20枚雞胚放入溫箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持濕度。4日后入孵第二批蛋，再4日后入孵第三批蛋。當第一批雞胚10日齡時，法氏囊病毒乳液加等體積雙抗30min；用常規的絨毛尿囊膜接種法，接種法氏囊病毒乳液；然后用熔化石蠟封口，放入溫箱繼續孵育，逐日觀察。24h內無死亡的棄掉，48h以后死亡的雞胚放入4℃保存，120h收集死活胚放入4℃。收獲雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，將絨毛尿囊膜加PBS緩沖液無菌研磨，研磨后4℃放置1h，加等體積氯仿充分混勻至乳懸液，搖床過夜，反復凍融3次后，進行第二次接毒。同上述過程進行第三次接毒。第三次接毒收獲的絨毛尿囊膜研磨后，用瓊脂擴散試驗檢測病毒效價，被檢病毒與標準法氏囊陽性血清出現明顯的沉淀線。

2.2引物的設計與合成

根據genbank登錄IBDVVP2基因參考序列和表達載質粒pFastBacHTA表達閱讀框設計VP2基因擴增引物：P1：5-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3；P2：5-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3：兩頭分別引入EcoRI和Xhol酶切位點。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3病毒RNA的提取

用Trizol法提取RNA，具體步驟為：取250μL病毒液于一普通的1.5mL EP管中，加入750uL Trizol，震蕩混勻，靜置5min。加入150μL氯仿，震蕩混勻，4℃離心，12，000r/min，5min。取上清加入450μL異丙醇，顛倒混勻，4℃離心，12，000r/min，12min。棄液體，加1mL75%DEPC乙醇洗滌，4℃離心，12，000r/min，5min。棄液體，虹吸，干燥沉淀。加9μL DEPC水，50℃水浴10min，開始反轉錄。

反轉錄步驟為：10μL RNA、1μL隨機引物和4μL dNTP混勻，65℃水浴8min后迅速冰浴5min。再加入4μL Buffer、1μL反轉錄酶和1μL RNaseinhibitor，37℃水浴2-3h。以反轉錄產物為模板，P1和P2為引物進行PCR反應。

PCR反應體系：5×StarBuffer 5μL，dNTP 2μL，4μL模板，P1和P2各0.5μL，Primestar 0.25μL，ddH，O12.75μL。PCR反應條件：98℃預變性10s；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸100s，共30個循環，72℃終延伸10min。凝膠電泳以鑒定分子量大小。將PCR產物按照AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收。取4.5μL回收產物加入5μLSollution Ⅰ和0.5μL Venter，混勻，4℃過夜。將連接產物轉化入E.coli DH5 α感受態細菌，涂布在用LB配制的1.5%的瓊脂平皿上（含氨芐青霉素100mg/L），37℃培養14h。挑單菌落接種入LB（含氨芐青霉素100mg/L），振搖培養12h。按Plasmid Minikit Ⅰ（100）說明書提取質粒。質粒用EcoRI和Xhol雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為T-VP2。送上海生工測序。

2.4分離株VP2序列分析及推導氨基酸序列分析

測序結果表明，分離株VP2基因核苷酸長度為1389bp，推導氨基酸序列含有347個氨基酸，采用DNAstar軟件對測序結果進行分析，對照IBDV經典強、弱毒株及超強毒株高變區氨基酸序列分析分離株VP2分子特征。

2.5數據分析

分離株VP2高變區遺傳進化樹分析應用生物軟件DNASTAR，對分離株和其他40株登錄在GenBank中的參考毒株的VP2基因高變區（435bp）進行進化樹分析，參考毒株及登錄號為：JF907703.1。

3結果與分析

3.1病毒純化繁殖結果

病料經無菌處理及雞胚繁殖、通過差速離心和密度梯度超速離心后負染、電鏡觀察表明：病毒的三維立體結構表明，IBDV病毒顆粒并非球形，呈T=13對稱，五倍軸延伸直徑為72nm，而三倍軸延伸直徑為66nm（見圖1）。

3.2VP2基因擴增結果

VP2基因擴增圖譜（見圖2）。

3.3T-VP2酶切鑒定結果

T-VP2酶切鑒定結果（見圖3）。

3.4IBDV同源性分析結果

測序結果表明，VP2基因核苷酸長度為1356bp，推導編碼452個氨基酸。采用DNAstar軟件將IBDV株VP2基因與國內外已報道的VP2基因核苷酸序列進行同源性比對。結果表明，IBDV株VP2核苷酸序列與日本超強毒株OKYM同源性最高為99.2%，與其他兩株超強毒株同源性高達98.9%、97.9%，而與強毒株52/70株和變異株variant E同源性較低分別為96.5%與96.2%，與中等毒力致弱株B87和2512、經典弱毒株D78和Cu一1以及疫苗株CEF94同源性在96.0%～96.4%之間，與Ⅱ型毒株同源性最低分別為81.6%、81.8%（見圖4）。

同時，對VP2氨基酸序列進行同源性分析，結果表明IBDV VP2氨基酸序列與超強毒株OKYM、HK46同源性最高均為99.6%，與強毒株52/70同源性次之為99.1%，與弱毒株及變異株同源性相對較低，從氨基酸水平表明IBDV分離株與強毒株關系密切（見圖5）。

3.5IBDVVP2高變區氨基酸序列分析結果

IBDV分離株VP2同源性與超強毒株最高，而IBDV病毒毒力相關分子和致病性分子標志主要分布在高變區，因此采用DNAstar軟件對IBDV VP2高變區與強毒參考毒株進行比對分析，結果表明，除222位點外，IBDV VP2高變區具備與超強毒株高變區一致的特征性氨基酸，即第249位和第254位氨基酸為O和G，SWSASGS七肽區不變，第279和第284位氨基酸分別為D和A，第294和第299位分別是特征性氨基酸I和S，盡管該分離株第222位是S而不是典型超強毒株的A，但其余關鍵位點均與強毒株相符（如圖6）。

3.6IBDV VP2遺傳進化分析

根據IBDV VP2高變區核苷酸序列與參考毒株相應序列，采用軟件MEGA 5.1構建基因進化樹進行分析。結果表明，這些毒株共形成2個大的分支：血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中血清Ⅰ型毒株又分為超強毒株、強毒株、變異株和弱毒疫苗株4個小的分支，IBDV與強毒株HK46、OKYM、KSH屬同一進化分支，親緣關系最近，與變異株、強毒株次之，與弱毒疫苗株親緣關系最遠，說明與強毒株具有更密切的親緣關系（圖7）。

4討論

IBD是危害我國養雞業的重要傳染性疾病，在我國不同地區都有發生的報道，自上世紀80年代以來，歐洲及我國相繼出現IBDV強毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的流行，尤其是從21世紀初變異株和強毒的流行，已嚴重威脅著包括我國在內的世界養雞業的發展。在我國相繼報道了HZ株、GZ株、安徽地區分離株等，但在山西地區還未見有報道，本實驗是首次在山西地區分離到超強毒株。

本病通常用疫苗預防即能取得較好的效果，但近幾年不斷的有養雞場發生大量的雞感染死亡。大多是由于IBDV變異株的抗原性和經典疫苗株間有差異，引起免疫抑制。或是vvIBDV的出現不僅能產生免疫抑制，其超強的致病力能導致雞群的高死亡率。本實驗采樣雞場同樣具有較高的死亡率，其特征與國內外雞感染超強毒株后臨床特征一致。

已有報道VP2攜帶宿主保護性抗原決定簇，具有至少2-3個中和性抗原位點，可誘導產生保護性中和抗體，并且有血清型特異性。另外VP2的七肽區決定其致病性和毒力。經過對多株vvIBDV VP2的研究對比，分析出其具備3個重要特征：①在249和254位上的氨基酸分別為O和G，而非K和S，從而保證其抗原性不發生變異；②七肽區保持SWSASGS不變，且279和284位分別為D和A，而非N和T，這是IBDV毒株具有致病力的必要條件；③在222、294和299位上具有3個特征氨基酸，分別為A、I和S，這3個氨基酸使超強毒的親水性發生變化，從而使毒力增強。本實驗從山西地區分離到的IBDV分離株完全符合以上VP2基因的重要特征，由此可證明其為vvIBDV。