種植體周圍炎齦溝液中MMP—8和MMP—13表達水平的研究

朱白雪 戴曉瑋 高曉蔚

[摘要]目的：探討基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）-8和基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達與種植體周圍炎的關系，評價其可否作為種植體周圍炎診斷的客觀指標。方法：使用吸潮紙尖提取40例健康種植體周圍齦溝液樣本，40例種植體周圍炎齦溝液樣本，分別記錄其探診出血指數（Sulcular bleeding index，SBI），探診深度（Probing depth，PD），并拍攝X線片測量種植體周圍牙槽骨喪失（Bone loss，BL）情況。使用ProcartaPlexTM多因子分析技術進行細胞因子定量檢測并分析。結果：種植體周圍炎組SBI和PD值均高于健康種植體組，差異有統計學意義（P<0.05）。種植體周圍炎組GCF中MMP-8含量均高于健康種植體組，差異有統計學意義（P<0.05）；但MMP-13在種植體周圍炎組和健康組齦溝液中的含量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。MMP-8含量與SBI、PD和BL正相關關系。結論：種植體周圍炎齦溝液中MMP-8表達水平升高，與臨床種植體周圍指標有一定的相關性，可作為種植體周圍炎早期診斷和治療的輔助指標。

[關鍵詞]種植體周圍炎；MMP-8；MMP-13；齦溝液；生物標記物；臨床指標

[中圖分類號]R780.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）09-0126-04

Expression of MMP-8 and MMP-13 in Gingival Crevicular Fluid of Peri-implantitis

ZHU Bai-xue1，DAI Xiao-wei2，GAO Xiao-wei1

（1.Department of Stomatology，the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China；

2.Planting Center，Urumqi Stomatological Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-8 （MMP-8） and matrix metalloproteinase-13 （MMP-13） expression and peri-implantitis， and evaluate whether it can be used as an objective indicator for early diagnosis of peri-implantitis. Methods 40 cases of gingival crevicular fluid around healthy implants and 40 cases of peri-implantitis gingival crevicular fluid samples were extracted with moisture absorbing papertips. The sulcus bleeding index， probing depth and X-ray were recorded.Quantitative detection and analysis of MMP-8 and MMP-13 by ProcartaPlexTM multifactor analysis. Results The values of SBI and PD in the peri-implantitis group were higher than those in the healthy implant group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The content of MMP-8 in GCF of peri-implantitis group was higher than that of the healthy implant group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the content of MMP-13 in the gingival crevicular fluid between the peri-implantitis group and the healthy implant group（P>0.05）. Existence of positive correlation between MMP-8 and SBI、PD and BL. Conclusion Increased expression of MMP-8 in gingival crevicular fluid has a certain correlation with clinical indicators of implants， and can be used as an auxiliary indicator for early diagnosis and treatment of peri implant inflammation.

Key words： peri-implantitis； MMP-8； MMP-13； gingival crevicular fluid； biomarkers； clinical indicators

種植體周圍炎是種植修復遠期失敗的主要原因之一[1-2]。據報道其發病率為18%～35%[3-4]。近十年的分子生物學及免疫學研究發現，種植體周圍炎患者齦溝液中的細胞因子含量變化與該病的發生、發展密切相關，可作為種植體周圍炎早期診斷和治療的重要指標[5]。基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是免疫應答過程中產生的一類重要的蛋白溶解酶，負責組織降解和再生蛋白，通過水解肽鏈裂解蛋白的同時能夠通過激活其自身活性從而增強細胞因子、趨化因子和生長因子的蛋白質水解和炎性反應過程，在結締組織和骨組織的破壞吸收過程中起重要作用。與牙周炎，齲病，頜骨囊腫，惡性腫瘤等組織破壞性疾病密切相關[6-8]。MMP-8是齦溝液中的主要膠原酶，由多核細胞釋放，然而近年來一些研究表明非多核細胞，如軟骨細胞，內皮細胞，成牙本質細胞等亦可產生MMP-8，與細胞外基質Ⅰ型膠原的降解密切相關[9]。MMP-13在種植體周圍炎的發生發展過程中起著重要作用，其含量在一定程度上反映了種植體周圍炎的演變過程，另外它在刺激破骨細胞活力方面的特性使其有望能夠在已發生骨吸收的界面重新形成骨結合方面有所貢獻[10-11]。本研究主要檢測MMP-8、MMP-13在健康種植體和炎癥種植體齦溝液中的表達水平的差異，判斷其與探診深度（Probing depth，PD）、齦溝出血指數（Sulcular bleeding index，SBI）和牙槽骨喪失（Bone loss，BL）的相關性，為診斷和治療種植體周圍炎提供依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象：按照納入及排除標準選擇2016年12月-2017年12月就診于烏魯木齊市口腔醫院的種植修復患者80例（80顆）。通過倫理審查后，根據種植體周圍情況分為種植體周圍炎組（40顆）和健康種植體組（40顆）。

1.1.1 納入標準：①年齡20～60歲者；②種植體型號為瑞士Straumann種植體系統者；③種植義齒行駛功能1年以上者；④種植義齒修復類型不限。種植體周圍炎組需根據美國牙周病學的指導方針，符合以下標準中1個以上者可診斷為種植體周圍炎：種植體周圍齦組織或黏膜充血、腫脹、溢膿；種植體周袋>3mm或有骨袋形成；種植體松動度≥Ⅰ度；X線檢查有輕～中度水平的骨吸收或伴個別垂直吸收，骨組織的喪失在種植體的第一個螺紋以下。健康種植體組：種植體周圍黏膜正常；種植體周圍無牙槽骨吸收；PD≤3mm，SBI<2。

1.1.2 排除標準：①全身系統性疾病者；②接受過種植體周圍炎治療者；③近3個月使用過抗生素及非甾體類藥物者；④過高咬合者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指標檢測：探診深度：用牙周探針沿牙齒長軸方向輕輕探到袋底或齦溝底，需特別注意探診壓力控制在20～25N，取最深處記錄牙周袋深度。

齦溝出血指數評分標準：0=牙齦健康探針無出血；1=探診出血，齦乳頭及邊緣無水腫及顏色改變；2=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，無水腫；3=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，輕度水腫；4=探診出血，齦乳頭及邊緣有顏色改變，明顯水腫；5=探診出血，有自發出血和顏色改變及水腫。

1.2.2 X片檢測：采用平行投照法拍攝X線片，并與種植體初始片比較，測量種植體周圍牙槽骨吸收量。

1.2.3 齦溝液（Gingival crevicular fluid，GCF）提取：棉卷隔濕、干燥牙面，將40#吸潮紙尖（天津加發醫療器械公司）插入齦溝底部，30s后取出，若紙尖帶血則棄去重新采集，將浸濕部分剪入凍存管中，每顆種植體重復取樣6次，分別位于種植體的頰側近中、中央、遠中，舌側近中、中央、遠中，每一樣本皆含4根吸潮紙尖，-70oC冷凍保存。

1.2.4 MMP-8和MMP-13含量測定：取出ProcartaPlex試劑盒（杭州聯科生物公司）提供的標準品，2 000xg離心10s，加入250μl的1X樣品緩沖液，于其余7個試管中加入150μl樣品緩沖液，從溶解的標準品中取出50μl放入2試管中，上下吹打10次搖勻，盡量避免氣泡產生，從管2中吸取50μl放入管3中，搖勻，依次轉移，完成標準品的梯度稀釋。室溫下解凍標本20min，4℃離心（1 000r/min）10min取上清液，在96孔ProcartaPlex多因子檢測試劑盒的每孔加入50μl微球混合液；靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復3次；30μl的Universal Assay Buffer+20μl的標準品或樣本；孔板封膜，室溫振蕩孵育2h；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復3次；每孔加入25μl生物素標記的檢測抗體；孔板封膜，室溫振蕩孵育30min；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復3次；每孔加入50μl Streptavidin-PE；孔板封膜，室溫振蕩孵育30min；去除封膜，將96孔板置于磁性分離板上，靜置3min，倒置去除孔板中的液體；每孔加入150洗液洗滌，重復3次；每孔加入100μl Reading Buffer；室溫振蕩5min使微球懸浮后上機檢測MMP-8和MMP-13含量。

1.3 統計學分析：應用SPSS 22.0軟件統計分析結果，MMP-8、MMP-13及PD符合正態分布采用獨立樣本t檢驗，MMP-8和MMP-13的含量與種植體臨床指標的相關分析采用相關性檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較：本次共80例患者，每組40例（40顆），兩組年齡、性別及種植部位比較，差異無統計學意義（P>0.05）；但種植體周圍炎組的PD、SBI及BL均高于健康種植體組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組齦溝液中MMP-8及MMP-13含量比較：種植體周圍炎組齦溝液中的MMP-8含量明顯高于健康種植體組，差異有統計學意義（P<0.05）；種植體周圍炎組齦溝液中MMP-13含量高于健康種植體組，但差異不具有統計學意義（P=0.149）。見表2，數據分布情況見圖1。臨床指標PD、SBI和BL與MMP-8表達均呈正相關，差異有統計學意義（P<0.05），但相關程度密切性較低，見表3。

2.3 MMP-8含量對種植體周圍炎的診斷能力：種植體周圍炎齦溝液中MMP-8含量診斷種植體周圍炎的靈敏度為0.65，特異度為0.68，比值比為3.86（95%CI：1.53～9.75，P=0.004）。

3 討論

種植體周圍炎是一種由于細菌聚集和機體免疫反應所引起的種植體周圍軟、硬組織的慢性進展性炎癥反應。目前臨床常規應用的診斷方法如臨床檢查和X線診斷只能夠診斷疾病發生后的嚴重程度，無法對疾病的整個活動過程進行預測和判斷。齦溝液是通過溝內上皮和結合上皮從牙齦結締組織滲入到齦溝內的液體，其成分與該部位的炎癥程度密切相關[12]。學者們已經就齦溝液中生物標記物的表達水平對牙周和種植體周圍疾病的預測和診斷做了大量研究，希望通過對種植體齦溝液內生物標記物的檢測提升對疾病早期診斷的能力，能夠在出現不可逆的骨吸收之前采取相應的治療措施[13]。

Christoph等提取了504顆種植體及493顆鄰近天然牙的齦溝液，ELISA定量檢測MMP-8等基質金屬蛋白酶的含量，結果顯示超過90%的位點可檢測到MMP-8，且種植體齦溝液中MMP-8與鄰近牙齒MMP-8的含量存在中等程度的相關性，與臨床指標PD、SBI和BL的也存在一定的相關性，但相關性均較差，與本研究結果一致[14-15]。Costajunior等分別提取健康種植體患者和存在早期種植體失敗患者的口腔黏膜，PCR測定其MMP-8基因型，結果顯示病例組MMP-8基因T/T型占63.75%，C/T型占25%，而對照組C/T型占48%，T/T型占38%，存在統計學差異，說明MMP-8基因型為T/T時，已經形成了骨結合的種植體發生失敗的危險性較大。綜上所述，MMP-8在種植體周圍炎的發生發展過程中起到了很重要的作用，可以作為一個早期預防和輔助診斷種植體周圍炎的重要依據之一[16]。許多研究表明，牙周炎患者齦溝液中MMP-13的含量明顯增加，齦溝上皮和牙齦成纖維細胞中均有發現，但MMP-13在種植體周圍炎齦溝液中的表達水平存在一定的爭議，MMP-13在種植體周圍炎中的作用機制有待進一步研究[11，17]。李德超等在對28顆健康種植體、12顆炎癥種植體和40顆健康天然牙齦溝液中MMP-13的表達水平檢測過程中發現，健康種植體組與種植體周圍炎組的MMP-13表達存在明顯的統計學差異，但健康種植體與健康天然牙之間沒有區別，且MMP-13的含量與PD、SBI的相關系數均大于0.8。而在本研究中種植體周圍炎組MMP-13的含量高于健康種植體組，但差異并不具有統計學意義[10]。這種研究結果的差異可能是因為樣本量差異造成的。Marco等在種植釘植入6個月后分別提取了純鈦組和氧化鋯組愈合帽周圍牙齦組織，免疫組化檢測MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9和MMP-13的表達水平，結果顯示只有MMP-8的含量在兩組中具有統計學差異，而牙齦的術后重建與恢復效果，純鈦組優于氧化鋯組，說明種植體周圍軟組織的恢復與重建可能與MMP-8的表達水平密切相關[11]。

本研究采用的是以Luminex為平臺的ProcartaPlex檢測技術定量檢測MMP-8和MMP-13的表達水平，采用不同熒光強度的熒光染料標記微球，根據與標記了抗體的微球在樣本中結合抗原的質量定量檢測標記物，該方法與常規ELISA檢測方法相比，對取樣的要求較低，即使樣本沾染血液，對實驗結果不會存在較大的影響[18-19]。

4 結論

MMP-8的表達水平與種植體周圍炎的發生發展密切相關，與探針出血、探診深度和牙槽骨吸收水平存在一定的相關性。可以將MMP-8同其他生物標記物一起聯合診斷作為早期診斷和預防種植體周圍炎的輔助依據，提升種植體周圍炎的早期診斷治療的能力，而對MMP-13的研究有待進一步探索。

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[收稿日期]2018-06-01 [修回日期]2018-07-16

編輯/朱婉蓉