移植途徑對骨髓間充質干細胞調節小鼠心臟移植排斥反應的影響

龔勇泉，曹健斌，韋成信，李富驪，黃維佳

骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有免疫調節功能，器官移植受體接受BMSCs移植后，能夠減少免疫抑制劑的應用，甚至誘導免疫耐受［1-3］。但是不同途徑注射BMSCs后，細胞在體內的分布不同，存活時間不同，有可能影響該細胞發揮免疫調節作用，相關研究報道較少［4］。因此有必要研究注射途徑對BMSCs調節器官移植排斥反應的影響，為臨床器官移植領域應用BMSCs提供實驗依據。本研究在頸部心臟移植模型的基礎上，通過移植心臟右心室腔內注射、移植心臟升主動脈注射和心肌注射3種不同途徑移植BMSCs，對比觀察移植心臟的存活時間，心臟移植物內BMSC的存活情況，移植心臟內的巨噬細胞比例，心臟的病理改變，比較3種細胞注射移植途徑的優劣。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級近交系C57和BALB/c小鼠各48只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，周齡約6～8周，體質量19～24 g，實驗動物的使用嚴格遵守柳州市人民醫院實驗動物使用管理規定。

1.2 主要試劑與儀器 C57小鼠綠色熒光骨髓間充質干細胞（eGFP-BMSCs）、小鼠間充質干細胞完全培養基、胰酶購于賽業（廣州）生物科技有限公司，氯胺酮購于福建古田藥業公司，甲苯噻嗪購于Sigma公司，0.1%Ⅱ型膠原酶購于Invitrogen公司，ACK紅細胞裂解液、小鼠流式細胞抗體FITC-CD11b、PerCP-F4/80購于BD公司。

1.3 骨髓間充質干細胞的培養 C57小鼠eGFP-BMSCs細胞表面標志為CD29+、CD44+、CD34+、CD117-、Sca-1+。細胞加入小鼠間充質干細胞完全培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養，在細胞達到80%融合時應用0.125%胰酶消化傳代，傳至3代后的細胞可用于細胞移植實驗。

1.4 小鼠頸部心臟移植模型的建立 供體雄性BALB/c小鼠，受體雄性C57小鼠，麻醉采用腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和25 mg/kg甲苯噻嗪的混合液。供體手術：正中腹部剪開，暴露下腔靜脈，注入4℃肝素生理鹽水1 mL（肝素濃度100 U/mL)，待1 min后橫斷腹主動脈和下腔靜脈全身放血，將皮膚切口延長至頸部，剪開膈肌，沿雙側腋前線剪開胸廓，將整個胸前壁向上翻起，暴露心臟，局部冰泥降溫。游離上腔靜脈以及下腔靜脈并結扎離斷，靠近無名動脈處離斷升主動脈，游離肺動脈主干，盡可能靠近分叉處離斷，5-0絲線一次集束結扎左右肺靜脈、左上腔靜脈，在結扎線遠心端剪斷，取出供心，置于預冷的生理鹽水中。受體手術：受體小鼠右側頸部作一反“L”形切口，顯露并切除右側胸鎖乳突肌，游離右側頸總動脈以及頸外靜脈，取出供心，將供體升主動脈與受體頸總動脈行端側吻合，供體肺動脈與受體頸外靜脈行對端吻合。開放血管夾后，可見心臟立即開始跳動，手術成功，間斷縫合皮膚切口，術后小鼠單籠喂養。

1.5 實驗動物分組以及干細胞移植 心臟移植手術成功后，使用隨機數字表法將受體小鼠分為A組、B組、C組和D組，每組各12只。A組在移植成功后立即經過移植心臟升主動脈注射C57來源eGFP-BMSCs懸液30 μL（含1×106細胞），B組在同樣時間點經過移植心臟右心室腔內注射相同數量細胞，C組在同樣時間點向移植心臟心肌內注射相同數量細胞，D組為空白對照組。

1.6 移植物內巨噬細胞比例檢測 移植術后第7天，每組各處死4只受體小鼠，獲取心臟移植物并橫斷分為上中下3個部分，將下1/3移植心臟剪碎，使用0.1%Ⅱ型膠原酶在5%CO2培養箱內消化60 min，70 μm濾網過濾，ACK紅細胞裂解液裂解紅細胞，加入FITC-CD11b，PerCP-F4/80流式細胞檢測抗體，孵育15 min，PBS沖洗細胞2次，采用流式細胞學檢測移植物內巨噬細胞比例，取4次檢測結果的平均值為最后結果。

1.7 病理學檢測 將切取的移植心臟上1/3部分經福爾馬林固定，常規石蠟包埋，病理切片，行HE染色，觀察組織病理改變。中1/3部分使用OCT包埋后冰凍切片，在40倍熒光顯微鏡下觀察eGFP-BMSCs細胞在心臟移植物中的存活情況。

1.8 移植心臟存活時間觀察 術后每日通過直視和觸診檢查移植心臟的跳動情況，必要時可以將小鼠麻醉后切開皮膚判斷移植心臟的跳動情況，心臟完全停止跳動為移植心臟死亡，記錄移植心臟的存活時間。

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 eGFP-BMSCs細胞的培養 體外培養的BMSCs生長良好，24 h能貼壁生長，48 h細胞明顯增多，形態呈梭狀、星形，見圖1a。細胞傳至第7代時，熒光顯微鏡下觀察細胞仍呈較強的綠色熒光表達，見圖1b。

2.2 頸部心臟移植手術情況 共完成48例小鼠頸部心臟移植，無手術死亡，移植心臟恢復血液供應后心臟跳動良好。無干細胞移植后的相關死亡。術后受體動物存活良好。

2.3 移植心臟內綠色熒光細胞存活情況 移植術后第7天，A組移植心臟內可見綠色熒光信號，但B組、C組和D組移植心臟內未見明顯熒光信號，見圖2。

2.4 流式細胞檢查結果 移植術后第7天，A組移植心臟內巨噬細胞占浸潤白細胞的比例高于B組、C組和D組，B組和C組明顯高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05），B組和C組差異無統計學意義，見表1。

2.5 移植心臟的病理變化 術后第7天心臟組織病理學檢測結果顯示，A組移植心臟排斥反應受到明顯抑制，間質內細胞浸潤少，局灶性的心肌細胞損害，見圖3a，B組和C組移植間質內可見多灶性淋巴細胞浸潤并伴有心肌細胞變性壞死，見圖3b、c，D組小鼠心臟呈急性排斥反應，滿視野大量白細胞浸潤，心肌結構消失，心肌壞死，見圖3d。

2.6 移植心臟存活時間 A組移植心臟存活時間長于B組、C組和D組，B組和C組的移植心臟存活時間長于D組，差異有統計學意義（P＜0.05），B組和C組差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of macrophages proportion in the heart graft infiltrating leukocytes and heart graft survival between four groups表1 各組心臟移植物內巨噬細胞的比例以及移植心臟存活時間 （±s）

Tab.1 Comparison of macrophages proportion in the heart graft infiltrating leukocytes and heart graft survival between four groups表1 各組心臟移植物內巨噬細胞的比例以及移植心臟存活時間 （±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F巨噬細胞比例（n=4，%）49.6±4.5 20.4±3.3a 26.8±7.5a 6.3±1.3abc 58.351＊＊移植心臟存活時間（n=8，d）17.6±1.8 12.8±1.6a 12.1±1.9a 7.2±0.9abc 49.335＊＊

3 討論

BMSCs移植途徑常用方法有靜脈注射、移植器官供血動脈注射和移植器官局部注射等。有文獻報道，BMSCs的治療效果受到細胞注射途徑的影響［5-6］，但是細胞注射途徑是否影響該細胞調節器官移植免疫排斥反應，目前還不清楚，相關方面的研究較少。

本研究結果顯示，3種途徑注射BMSCs，均可延長移植心臟的存活時間，但是動脈途徑比靜脈途徑和局部注射效果更顯著，而靜脈途徑和局部注射兩種途徑對比則沒有差異。組織病理學檢查證實BMSCs能夠減輕急性排斥反應。筆者分析這可能和移植細胞在體內分布不同有關。動脈途徑注射BMSCs后，大量細胞直接進入心肌微循環，通過受損的血管內皮細胞進入心肌間質內定植。而移植心臟右心室腔內注射細胞后，細胞經過移植心臟右心室進入肺動脈，回流到受體的頸外靜脈，從而進入受體的靜脈回流系統，由于肺毛細血管網的濾過作用，導致大量細胞滯留于肺內，進入體循環系統的細胞大大減少［7］，雖然仍有部分細胞能通過趨化作用進入移植心臟內定植，但細胞數量對比動脈注射途徑明顯減少。而心肌內注射細胞，細胞雖然可以直接進入心肌組織間隙，但是這種注射方法導致大量細胞聚集在注射部位附近，引起干細胞的大量死亡［8］，定植的細胞較少。熒光顯微鏡證實了動脈途徑注射后BMSCs存活時間超過7 d，但是靜脈和局部2種方法注射后細胞存活未能超過7 d，這與BMSCs在移植心臟內的定植量有關，定植細胞數量多，細胞存活時間長，因而能更加長久地發揮免疫調節作用，改善細胞的存活。

本研究還證實，3種途徑注射BMSCs后，移植物內浸潤白細胞中巨噬細胞的比例較對照組明顯增加，動脈途徑較靜脈途徑和心肌內注射途徑增加更顯著。筆者分析這與移植心臟內定植的BMSCs有關，移植物內的巨噬細胞來源于供體心臟內固有的巨噬細胞和受體循環系統的單核細胞向移植物內趨化［9］，供體來源的巨噬細胞由于急性排斥反應而大量死亡，但是移植物內的BMSCs能夠減少排斥反應導致的移植心臟內巨噬細胞的死亡，同時BMSCs還可以通過修復移植心臟的損傷，改善細胞的存活環境，提高巨噬細胞的存活率，從而增加了巨噬細胞的比例。BMSCs不僅通過分泌細胞因子、與細胞直接接觸或通過調節T細胞等多種途徑調節免疫反應［10］，而且還能在移植心臟內誘導調節巨噬細胞的形成，間接調節排斥反應［11］，協同改善移植器官的存活。

總之，本研究證實了靜脈注射、移植器官供血動脈注射和移植器官局部注射3種方法均能顯著改善小鼠移植心臟的存活時間，但是動脈途徑較靜脈途徑和心肌內注射能更加顯著延長移植心臟的存活。其機制可能和移植心臟內BMSCs定植以及移植物內浸潤白細胞中巨噬細胞的比例增高有關。

Fig.1 The 3rdpassage eGFP-BMSCs cell morphology and green fluorescence expression of the 7thpassage（×40）圖1 第3代eGFP-BMSCs細胞形態以及第7代細胞綠色熒光表達情況（×40）

Fig.2 Green fluorescence cell survival in the heart graft at 7 post-operative day（×40）圖2 心臟移植術后第7天移植心臟內熒光細胞存活情況（×40）

Fig.3 The heart graft histological changes at 7 days after heart transplant（×40）圖3 心臟移植術后第7天移植心臟病理學改變（×40）