四氫姜黃素對壓力負荷引起的小鼠心肌肥厚的保護作用

曹星，王玉嶺，翟蒙恩，馬繼鵬，王曉武，馮建宇△

病理性左心室肥大是對心臟應對多種刺激或疾病如高血壓、心肌梗死、主動脈瓣狹窄、心力衰竭和神經激素等的一種病理性反應［1］。這些因素最初會刺激心臟蛋白質合成并改善心輸出量，這種情況通常稱為代償性心臟肥大，但持續的心臟肥大最終會失代償，引起細胞死亡和纖維化，導致心力衰竭、猝死和卒中［2］。因此，防治病理性心肌肥厚具有非常重要的臨床意義。研究證實，腎素-血管緊張素系統抑制劑和鈣通道阻滯劑是降低左心室質量最有效的藥物［3］。然而，這些外源性生物合成藥物具有明顯的不良反應，如干咳、血管性水腫、低血壓癥狀、暈厥、頭暈、頭痛和臉部發紅等［4-5］，限制了其臨床應用。因此亟須尋找新的有效藥物治療病理性心肌肥厚。四氫姜黃素（Tetrahydrocurcumin，THC）是姜黃素在體內的主要代謝物之一，具有抗炎、抗氧化和心肌保護等多種藥理作用［6-7］。特別值得注意的是，THC的生物活性明顯優于姜黃素［8］。以往研究證實，姜黃素能有效緩解壓力負荷引起的心肌肥厚［9］，但THC能否減輕壓力負荷引起的心肌肥厚尚少見報道。本研究旨在探究THC能否減輕壓力負荷引起的病理性心肌肥厚。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。C57BL/6小鼠，雄性，無特定病原體（SPF）級，體質量20～22 g，8～10周齡，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。C57BL/6小鼠飼養于清潔級環境，自由進食進水。（2）主要試劑。THC、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Sigma公司）；抗GAPDH、α-肌球蛋白重鏈（α-MHC）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）抗體（Santa-Cruz公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；羊抗兔、羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；心房鈉尿肽（ANP）引物、GAPDH引物（生工生物工程上海股份有限公司）；Minivent 845小動物呼吸機（Harvard Apparatus公司）；Western成像儀、實時定量PCR儀（Bio-Rad公司）；小動物超聲儀（Visualsonic公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、建模及給藥方式 將24只C57BL/6小鼠按照體質量編號后用隨機數字表完全隨機分為4組，每組6只，即假手術（Sham）組、THC組、主動脈弓縮窄（TAC）組和TAC+THC組。參考文獻［10］方法，使用微創TAC術建立小鼠壓力負荷性心肌肥厚模型。具體操作步驟如下，小鼠用2%異氟烷誘導麻醉；用20 G針頭氣管插管并通氣（Minivent 845）；用1%～2%的異氟烷維持麻醉；在第二肋間做縱向切口（約0.5 cm）并從肋間隙開胸；鈍性分離胸腺、脂肪組織與主動脈弓；在無名動脈和左頸總動脈之間墊27 G針并結扎主動脈弓（7-0絲線）；取出針頭，留下狹窄區域；逐層關胸；手術完成后，將小鼠轉移至加熱墊并密切監測。Sham組和THC組小鼠進行開胸、分離主動脈弓、關胸等操作，但不結扎主動脈弓。術后THC組和TAC+THC組小鼠通過飲水攝入THC，給藥劑量為每天120 mg/kg，給藥4周。Sham組和TAC組小鼠術后自由進水4周，飲水內不添加THC。

1.2.2 心臟功能檢測 TAC術后4周，剔除小鼠胸前毛發。用VEVO 770小動物超聲儀檢測左室射血分數（LVEF）與左室短軸縮短率（LVFS）［1］。

1.2.3 心臟/體質量比、肺臟/體質量比檢測 超聲檢測結束后，將小鼠安樂死，取出心臟和肺，并測定心臟質量（HW）、肺臟質量（LW）和體質量（BW），計算心臟/體質量比（HW/BW）和肺臟/體質量比（LW/BW）。

1.2.4 心肌組織HE染色和Masson染色 將心臟組織浸入10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，石蠟包埋。制備5 μm厚的切片并分別用HE染色或Masson三色染色以評估心肌細胞橫截面積和膠原蛋白沉積情況。每張切片隨機讀取10個高倍視野，用Image J軟件對心肌細胞的平均橫截面積和膠原沉積程度進行定量評估。心肌纖維化的主要表現為心肌間質內膠原沉積增加，本研究通過比較各組小鼠心肌間質內膠原沉積程度來反映心肌纖維化程度。

1.2.5 Western blotting檢測心肌組織α-MHC和β-MHC蛋白表達 取各組動物心肌組織提取蛋白，提取方法參考文獻［11］。用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。在電泳加樣孔內加入等量蛋白質（40 μg），10%Bis/Tris凝膠分離蛋白，并用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。用TBST（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，0.1%Tween-20，pH=7.5）稀釋的脫脂牛奶（5%）封閉PVDF膜2 h，孵育抗α-MHC（1∶1 000稀釋）、β-MHC（1∶500稀釋）和GAPDH（1∶1 000稀釋）抗體，4℃過夜；用TBST洗滌3次；室溫孵育對應的二抗（1∶5 000稀釋）1.5 h；用TBST洗滌3次。使用Bio-Rad成像系統檢測蛋白質條帶并使用Image Lab軟件定量。GAPDH作為內部參照。

1.2.6 Real-time PCR技術檢測心肌組織ANP mRNA表達情況 在收集組織后，根據說明書的要求，使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取小鼠左心室組織總RNA，繼而將RNA逆轉錄成cDNA。用CFX96-C1000儀進行real-time PCR。ANP引物序列：上游5′-GTGCGGTGTCCAACACAGAT-3′，下游 3′-GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-5′。GAPDH 引物序列：上游 5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游 3′-AGTTGCTG TTGAAGTCGC-5′。PCR循環參數：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。計算各組樣本熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數（Ct值），通過2-△△Ct法計算基因相對表達量。各組基因表達量以Sham組的相對值表示。

1.3 統計學方法 用SPSS 13.0統計學軟件進行統計分析，計量數據均以均數±標準差（±s）表示，差異性分析采用2×2析因設計方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THC可改善壓力負荷引起的心臟功能不全 TAC術后4周，各組小鼠典型超聲心動圖表現見圖1。與Sham組相比，TAC組小鼠LVEF與LVFS明顯降低（P＜0.05）。與TAC組相比，TAC+THC組LVEF與LVFS明顯升高（P＜0.05）；與Sham組相比，單純給予THC對小鼠心臟功能無明顯影響，見圖1、表1。

Fig.1 Representative echocardiography of mice in four groups圖1 各組小鼠典型超聲心動圖

Tab.1 Effects of THC treatment on cardiac function following transverse aortic constriction表1 THC處理對主動脈弓縮窄后心臟功能的影響（n=6）

2.2 THC可減輕心肌肥厚和肺淤血 TAC術后4周，與Sham組相比，TAC組小鼠HW/BW、LW/BW及心肌細胞平均橫截面積明顯增高（P＜0.05）。與TAC組相比，TAC+THC組HW/BW、LW/BW及心肌細胞平均橫截面積明顯降低（P＜0.05）。與Sham組相比，單純給予THC對小鼠HW/BW、LW/BW及心肌細胞平均橫截面積無明顯影響，見圖2、表2。

2.3 THC可緩解壓力負荷引起的心肌纖維化 各組小鼠心肌組織典型Masson染色見圖3。Masson染色結果顯示，Sham組、THC組、TAC組和TAC+THC組的心肌纖維化比例分別為0.45±0.25、0.62±0.45、7.18±1.35和3.35±1.04。THC、TAC因素的作用和TAC+THC交互效應的F值分別為21.176、141.155和25.201，均有統計學意義（P＜0.01）。與Sham組小鼠相比，單純給予THC對心肌組織膠原沉積無明顯影響。TAC組小鼠心肌組織內膠原沉積程度較Sham組明顯加重（P＜0.05），而給予THC處理可以明顯降低TAC術后膠原纖維沉積程度（P＜0.05）。

Fig.2 Representative HE staining images of heart tissue of mice in four groups(×400)圖2 各組小鼠心肌組織典型HE染色圖像（×400）

Tab.2 Effects of THC treatment on HW/BW ratio,LW/BW ratio,the mean cross-sectional area of cardiomyocytes following transverse aortic constriction表2 THC處理對主動脈弓縮窄后心臟/體質量比、肺臟/體質量比、心肌細胞平均橫截面積的影響 （n=6）

2.4 THC處理逆轉α-MHC/β-MHC比例倒置，降低心衰標志性分子ANP mRNA表達 TAC術后4周，與Sham組相比，TAC組小鼠心肌組織中α-MHC蛋白表達量明顯下降，而β-MHC蛋白和ANP mRNA表達量明顯增高（P＜0.05）；與TAC組相比，TAC+THC組心肌組織內α-MHC蛋白表達明顯升高，β-MHC蛋白和ANP mRNA表達則明顯下降（P＜0.05）。與Sham組相比，單純給予THC處理對α-MHC和β-MHC蛋白表達水平以及ANP mRNA表達水平無明顯影響，見圖4、表3。

3 討論

Fig.3 Representative Masson staining images of heart tissue of mice in four groups(×200)圖3 各組小鼠心肌組織典型Masson染色圖像（×200）

Fig.4 Representative Western blottings of α-MHC and β-MHC protein expression in heart tissue of mice in four groups圖4 各組小鼠心肌組織α-MHC和β-MHC蛋白表達免疫印跡

Tab.3 Effects of THC treatment on the expression levels of α-MHC,β-MHC and ANP following transverse aortic constriction表3 THC處理對主動脈弓縮窄后α-MHC、β-MHC和ANP表達的影響 （n=6）

心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因。壓力負荷引起的病理性心肌肥厚的重要病理改變是心肌重塑，主要包括心肌細胞肥大、心肌纖維化和心臟功能障礙等［12］。目前臨床上已經應用β受體阻滯劑［13］、血管緊張素轉換酶抑制劑［14］、血管緊張素受體拮抗劑［15］和鹽皮質激素受體拮抗劑［16］以及心臟再同步［17］等多種藥物和治療手段用于改善心功能，抑制甚至逆轉重塑。盡管如此，許多終末期心力衰竭患者最終需要進行心臟移植［18］。因此，亟須尋找新的有效藥物用于改善壓力負荷引起的病理性心肌重塑，改善患者預后。THC是姜黃素在體內的代謝產物之一。以往研究發現，THC具有明顯的心肌保護作用。Lau等［19］發現，日常飲食攝入THC可以明顯抑制腎大部切除術引起的腎臟組織纖維化和心肌肥厚。Ali等［20］證實THC可明顯減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。但THC能否抑制壓力負荷引起的心肌肥厚尚鮮見報道。

病理性心肌肥厚的標志性改變之一是心肌組織發生肥大，即心肌質量明顯增大［1］。筆者通過小鼠主動脈弓縮窄模型建立壓力超負荷引起的心臟肥大和心力衰竭模型，以確定THC治療是否可以逆轉心臟擴大，結果顯示，與TAC組相比，THC給藥可以明顯降低心臟/體質量比、縮小心肌細胞平均橫截面積，提示THC能夠有效減輕壓力負荷引起的心肌肥大反應。此外，THC還可降低肺臟/體質量比，提示THC能夠減輕壓力負荷引起的肺淤血。

哺乳動物心臟中特異性地表達2種肌球蛋白重鏈亞型，即α-MHC和β-MHC，且其表達量隨病理生理條件的變化而變化［21］。在成人心臟中表達的肌球蛋白重鏈亞型主要為α-MHC，因為α-MHC比β-MHC具有更強的ATP酶活性［22］。而胚胎期心臟組織中主要表達β-MHC。與相關研究結論一致［23］，本研究觀察到與正常心臟相比，肥大心臟中的α-MHC蛋白表達顯著下調，伴隨著β-MHC蛋白表達明顯上調；通過給予THC治療可逆轉由TAC引起的α-MHC向β-MHC表達的轉變。此外，ANP是目前心衰的標志性分子之一［24］，通過檢測ANP的表達情況，本研究進一步證實，THC可以明顯降低TAC引起的ANP mRNA表達水平增高。

壓力超負荷引起的心臟重塑的另一標志是心臟纖維化［25］。過量膠原沉積可損傷心肌舒張功能和收縮功能，引發室性快速性心律失常并最終導致心力衰竭［26］。本研究通過心肌組織Masson染色證實THC可以有效改善壓力負荷引起的心肌纖維化反應。有充分研究證據顯示，心臟纖維化是導致心臟功能不全的重要誘因［27］。本研究通過檢測各組小鼠心臟收縮功能發現，THC能夠明顯改善TAC引起的心臟功能受損。

綜上所述，本研究證實THC能夠明顯改善壓力負荷引起的心肌細胞肥大和心肌纖維化，緩解心肌重塑，進而改善心臟功能，為臨床上應用THC治療壓力負荷誘導的病理性心肌肥厚患者提供了理論依據。