微小RNA-375調控自噬抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖和轉移

王星星，宋虎，杜晨陽，王振，張建軍△，沈中陽

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，占原發性肝癌的85%～90%，并且是全球惡性程度最高的癌癥之一，經常在晚期發現并且預后不良［1-3］。手術切除和肝移植是HCC的主要治療手段，但即使手術切除后，HCC患者的5年生存率仍然不高，侵襲、轉移和復發是影響臨床治療和預后的主要因素［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）異常表達涉及許多人類疾病，特別是癌癥［5］。自噬（Autophagy）是一種細胞內降解過程，已被證明在多種生物功能中發揮著關鍵作用，包括細胞存活、神經元功能、線粒體翻轉、蛋白質降解和能量代謝等［6］。有證據表明自噬可以通過其降解過程保護HCC細胞免于由抗腫瘤劑誘導的細胞凋亡，自噬可能促進HCC細胞轉移［7］。本研究旨在探索miR-375介導Atg14調控自噬對肝癌細胞增殖和轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人SMMC-7721肝癌細胞系購自中科院上海細胞庫；miR-375引物、miR-375模擬物（miR-375 mimic）、miR-375抑 制 物（miR-375 inhibitor）、Atg14的小干擾 RNA（siRNA）購自廣州銳博生物科技公司；Atg14引物購自上海生工生物工程公司；胎牛血清（FBS）、培養基、胰酶購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉錄試劑盒以及實時定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；免疫細胞化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）購自上海漢恒生物科技公司；qRT-PCR儀器購自瑞士Roche公司；Nanodrop分光光度計和CO2培養箱購自美國Thermo公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；兔抗鼠泛素結合蛋白（P62）、Atg14、酵母Atg6同源物（Beclin1）、N-鈣黏素（NCadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-連環蛋白（β-catenin）、GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗購自美國CST公司，兔抗鼠輕鏈3（LC3）Ⅰ/Ⅱ多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞缺氧復氧模型建立及分組 培養人SMMC-7721肝癌細胞并傳代，將處于對數生長期細胞用胰酶消化后接種至6孔板，37℃、5%CO2培養箱培養細胞融合度為70%左右。分別用miR-375 mimics、miR-375 inhibitor、對照miRNA轉染細胞以及Atg14 siRNA、對照siRNA轉染細胞，分為miR-375 NC組、miR-375 mimics組、miR-375 inhibitor組以及siRNANC組、Atg14 siRNA組。各組轉染后置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，12 h后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后移除培養基，加入2 mL Hank’s培養液，放入模擬缺氧專用培養箱，模擬缺血（缺氧）狀態。1 h后移去Hank’s液，加入2 mL完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養6 h，模擬再灌注（復氧）狀態。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-375以及Atg14 mRNA的表達情況 Trizol法提取miR-375 NC、miR-375 mimics及miR-375 inhibitor組細胞總RNA，逆轉錄RNA獲得cDNA（根據操作說明書進行）。miR-375引物：上游5′-CCCGCGCGAGCCCGA?CAAACGC-3′，下游 5′-UCGUUUGUCGGGCUCGCGUGGG-3′；Atg14引物：上游5′-CATAACAACCCCGCCTACAC-3′，下游5′-TGCGTTCAGTTTCCTCACTG-3′；內參GAPDH引物：上游 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游 5′-GGCT?GTTGTCATACTTCTCATGG-3′。按說明書配制反應體系，經過94℃預變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，擴增45個循環。結果使用比較閾值法定量分析，計算方法為：目的基因定量拷貝數=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，對每一標本計算目的基因的拷貝數。

1.2.3 免疫細胞化學 經轉染處理后的miR-375 NC、miR-375 mimics及miR-375 inhibitor組細胞用胰酶消化，重新接種于24孔板中。37℃、5%CO2培養箱培養48 h后，室溫下4%多聚甲醛固定20 min，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶15 min，5%山羊血清封閉1 h，孵育一抗N-Cadherin、β-catenin（1∶500稀釋）在4℃環境過夜。室溫下孵育二抗1 h。二氨基聯苯胺（DAB）溶液顯色、蘇木精染核后光鏡顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 蛋白印跡實驗（Western blot） 各組細胞加入裂解液，充分裂解后用4℃，12 000 r/min，離心15 min，吸取上清。BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳后轉膜、封閉，加LC3、P62、Atg14、Beclin1、N-Cadherin、Vimentin、β-catenin與內參蛋白GAPDH一抗（1∶1 000稀釋），4℃環境下孵育過夜，TBST洗滌后HRP標記的羊抗兔二抗（1∶2 500）室溫孵育1 h，混合等體積的化學發光液與PVDF膜反應，曝光并保存圖片。采用圖像分析軟件Image J對Western blot實驗所得結果圖像進行灰度分析，自噬過程中，LC3Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（PE）結合轉變為自噬體（即LC3Ⅱ），因此以LC3Ⅱ作為自噬標記蛋白。所有結果以GAPDH為內參對照，結果用灰度比值表示。

1.2.5 自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體 將人SMMC-7721肝癌細胞接種至24孔板，培養至細胞融合度為50%～70%，用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染miR-375 NC、miR-375 mimics和miR-375 inhibitor組細胞，并在熒光顯微鏡下觀察細胞內自噬體情況。記錄每個細胞內自噬體的數量，比較組間細胞自噬表達情況。

1.2.6 平板克隆 分別用miR-375 mimics、miR-375 inhibitor、Atg14 siRNA轉染細胞，對照組轉染空載質粒，分為miR-375 NC組、miR-375 mimics組、miR-375 inhibitor組以及siRNA-NC組、Atg14 siRNA組和miR-375+Atg14 siRNA共轉組。將miR-375 NC組、miR-375mimics組、miR-375 inhibitor組和siRNA NC組、Atg14 siRNA組以及miR-375+Atg14 siRNA組均按相同密度接種在6孔板中（每孔加500個細胞），放入37℃、5%CO2培養箱培養1周后用結晶紫溶液（0.1%結晶紫）染色后觀察并計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學處理。符合正態分布的數據用均數±標準差（±s）表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測細胞中miR-375和Atg14 mRNA的表達 通過靶基因預測網站TargetScan 7.2進行靶點預測發現miR-375與Atg14的相關性評分均較高，且有相互結合的序列，見圖1。通過轉染miR-375 mimics、miR-375 inhibitor以及對照miRNA結果顯示，與miR-375 inhibitor組以及miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組中miR-375 mRNA的表達明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01），而Atg14 mRNA在miR-375 mimics組表達最低，在miR-375 inhibitor組表達最高，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Detection of miR-375 mRNA and Atg14 mRNA expression in cells by qRT-PCR表1 qRT-PCR檢測細胞中miR-375 mRNA和Atg14 mRNA的表達 （n=4，±s）

Tab.1 Detection of miR-375 mRNA and Atg14 mRNA expression in cells by qRT-PCR表1 qRT-PCR檢測細胞中miR-375 mRNA和Atg14 mRNA的表達 （n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與miR-375 NC組比較，b與miR-375 inhibitor組比較，P＜0.05

組別miR-375 NC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimics組F miR-375 mRNA 1.00±0.00 0.41±0.14a 2.62±0.59ab 42.213＊＊Atg14 mRNA 1.00±0.00 2.30±0.55a 0.48±0.14ab 32.372＊＊

2.2 免疫細胞化學檢測SMMC-7721細胞中NCadherin、β-catenin表達情況 與miR-375 inhibitor組以及miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組的β-catenin胞漿表達明顯增多，而N-Cadherin的胞漿表達明顯減少，見圖2。

2.3 Western blot檢測SMMC-7721細胞轉染后相關蛋白的表達情況 過表達miR-375導致LC3Ⅱ的蛋白表達降低，P62的蛋白表達水平增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。與miR-375 inhibitor組、miR-375 NC組比較，miR-375 mimics組Atg14、Beclin1蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3、表2。

2.4 自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體 miR-375 mimics組自噬體個數（4.25±1.26）明顯低于 miR-375 NC組（8.25±1.26），而 miR-375 inhibitor組自噬體個數（16.75±2.50）明顯高于miR-375 NC組，差異有統計學意義（n=4，F=48.531，P＜0.01），見圖4。

Fig.1 TargetScan 7.2 forecast results圖1 TargetScan 7.2預測結果

2.5 平板克隆 與miR-375 inhibitor組（154.00±6.48）、miR-375 NC組（100.25±3.59）比較，miR-375 mimics組（29.25±2.99）的細胞集落明顯減少，差異有統計學意義（n=4，F=736.061，P＜0.01）。與siRNA NC組（144.25±8.85）相比，Atg14 siRNA組（48.00±10.23）細胞集落減少，且在miR-375 mimics與Atg14 siRNA共同轉染后（29.25±5.19）細胞集落減少更加明顯，差異有統計學意義（n=4，F=217.70，P＜0.01），見圖5。

2.6 Western blot檢測干擾Atg14表達后相關蛋白的表達情況 Atg14 siRNA組N-Cadherin、Vimentin蛋白表達水平明顯低于siRNA-NC組，β-catenin蛋白表達水平明顯高于siRNA-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6、表3。

Fig.2 Immunocytochemical detection of N-Cadherin and β-catenin expression in SMMC-7721 cells（×400）圖2 免疫細胞化學檢測SMMC-7721細胞中N-Cadherin、β-catenin表達情況（×400）

Fig.3 Western blot analysis of related protein expressions圖3 Western blot檢測相關蛋白的表達情況

Tab.2 Relative expression levels of related proteins after SMMC-7721 cell transfection表2 SMMC-7721細胞轉染后相關蛋白的相對表達量（n=4，±s）

Tab.2 Relative expression levels of related proteins after SMMC-7721 cell transfection表2 SMMC-7721細胞轉染后相關蛋白的相對表達量（n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與miR-375 NC組比較，b與miR-375 inhibitor組比較，P＜0.05

組別miR-375 NC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimics組F LC3Ⅱ0.57±0.07 1.33±0.22a 0.29±0.06ab 61.777＊＊P62 0.59±0.12 0.20±0.02a 0.87±0.09ab 58.228＊＊Atg14 0.29±0.04 0.37±0.02a 0.11±0.02ab 97.504＊＊Beclin1 0.30±0.01 0.41±0.05a 0.21±0.03ab 36.747＊＊

Fig.4 Autophagy double-labeled adenovirus(mRFP-GFP-LC3)for detection of autophagosomes（×400）圖4 自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）檢測自噬體（×400）

Fig.5 Changes in cell proliferation in each treatment group圖5 各處理組細胞增殖變化情況

Fig.6 Western blot analysis of the expression of related proteins after interference with Atg14 expression圖6 Western blot檢測干擾Atg14表達后相關蛋白的表達情況

Tab.3 Relative expression of target protein after interference with Atg14 expression表3 干擾Atg14表達后目的蛋白的相對表達量（n=4，±s）

Tab.3 Relative expression of target protein after interference with Atg14 expression表3 干擾Atg14表達后目的蛋白的相對表達量（n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別siRNA-NC組Atg14 siRNA組t N-Cadherin 1.51±0.13 0.77±0.04 11.143＊＊Vimentin 1.09±0.06 0.68±0.05 5.195＊β-catenin 0.26±0.05 1.30±0.08 22.486＊＊

3 討論

自噬是細胞應激條件下的重要生存機制，miRNA調控自噬在腫瘤的發生和發展過程中具有重要的調節作用［8］。Yuan等［9］通過研究紫外線輻射耐受相關基因（UVRAG）和UVRAG靶向miRNA對胃癌自噬和細胞凋亡的調節作用，發現miR-183通過靶向人胃癌細胞中的UVRAG，抑制饑餓誘導的自噬和細胞凋亡。Hua等［10］證實miR-1過表達可通過抑制Atg3介導的自噬來改善非小細胞肺癌（NSCLC）細胞對順鉑（Cisplatin）的化療敏感性。而Liu等［11］通過研究miR-92b在乳腺癌自噬、增殖和侵襲中的主要作用，發現miR-92b的過表達促進了乳腺癌細胞中饑餓和雷帕霉素處理誘導的自噬。本研究表明，過表達miR-375能抑制Atg14表達，進而降低肝癌細胞內自噬體的形成和自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表達；反之抑制miR-375表達能促進Atg14表達，進而提高肝癌細胞內自噬體的形成和LC3Ⅱ、Beclin1的表達；說明miR-375能通過負性調控Atg14以抑制肝癌細胞自噬。

miRNA對肝細胞癌的調控作用同樣具有雙面性。Liang等［12］發現在肝癌組織中miR-29a下調及干擾素誘導的跨膜蛋白-3（IFITM3）上調，miR-29a可通過負性調控IFITM3抑制HCC細胞的遷移、侵襲和增殖。Wang等［13］研究結果表明miR-506能特異性地靶向調控Yes相關蛋白（YAP）mRNA的3′-UTR區，抑制肝癌細胞的遷移、侵襲和轉移。而Xu等［14］報道了miR-589-5p通過靶向有絲分裂誘導基因6（MIG-6）促進肝癌細胞生長，抑制miR-589-5p可能是抑制肝癌進展的可行方法。Hu等［15］研究發現肝癌細胞和組織中miR-665表達量顯著增加，miR-665通過抑制蛋白酪氨酸磷酸酶受體B（PTPRB）靶向抑制Hippo信號傳導活性，最終發揮促進腫瘤增殖、遷移和侵襲的作用。另有研究發現miR-375在多種類型的癌癥中顯著下調，如肝細胞癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、黑色素瘤、胰腺癌和神經膠質瘤［16］。Yan等［16］研究顯示miR-375可以抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化，并因此阻斷自噬體的形成，此過程使溶酶體融合用于降解和再循環。此外，Liu等［17］也發現miR-375在HCC中顯著下調，并且miR-375的過表達通過靶向調控另一種重要癌基因YAP來降低HCC細胞的侵襲和增殖。本研究表明，過表達miR-375可抑制肝癌細胞增殖，抑制肝癌細胞的侵襲、轉移能力；反之抑制miR-375表達可促進肝癌細胞增殖，提高肝癌細胞的侵襲和轉移能力；說明miR-375具有抗肝癌作用。

miRNA調控自噬作用于肝癌的機制復雜，可通過多種信號通路或靶點進行調控，如Atg、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、細胞外調節蛋白激酶（ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）通路等［18］。Wang等［19］研究結果表明miR-7通過靶向調控mTOR介導的自噬抑制肝癌細胞增殖，通過抑制自噬來增強miR-7的抗腫瘤活性。Zhang等［20］研究發現增強miR-142-3p表達可靶向miR-142-3p-ATG5/ATG16L1軸以減少索拉非尼誘導的自噬，增強索拉非尼誘導的細胞凋亡和抑制細胞生長，使肝癌細胞對索拉非尼敏感。Atg基因在自噬的激活和發生中起關鍵作用［21］。Si等［22］通過研究miR-23a對由敗血癥引發的自噬的作用，發現miR-23a在膿毒性損傷后被抑制，且能促進自噬并抑制高度炎癥反應，進一步的研究證實Atg12是miR-23a的靶標。Li等［23］通過實驗證實了Atg14為miR199a-5p的特異性靶點，并且Atg14部分地增強了miR199a-5p-增強的肝臟對葡萄糖和胰島素的耐受性。本研究通過TargetScan預測miR-375與Atg14具有高度的基因相關性；過表達miR-375可使Atg14表達量降低，肝癌細胞增殖、侵襲轉移能力降低，反之，肝癌細胞增殖、侵襲轉移能力升高；使用RNA干擾抑制Atg14表達可使miR-375對肝癌細胞增殖、侵襲轉移能力的抑制作用增強；說明Atg14是miR-375調控自噬作用于肝癌細胞的重要中間靶點，受miR-375且介導的自噬影響肝癌細胞。

綜上所述，與正常肝細胞相比，miRNA-375在肝癌細胞中表達更低，且通過靶向下調Atg14抑制自噬，進而抑制肝癌細胞增殖、侵襲和轉移能力，發揮抗腫瘤作用。miRNA-375靶向調控自噬抑制肝細胞癌為肝細胞癌的臨床治療提供了新思路。