余芳芳，楊國紅，李銘，陶燕燕，王秀娟，牛秀瓏，李玉明，趙季紅

血管內皮生長因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）陽性單核巨噬細胞是一群具有潛在淋巴管內皮細胞轉化功能的特殊細胞群，其在一定條件下可遷移到組織中，分泌血管內皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C），并能轉化為淋巴管內皮細胞而促進淋巴管的生成［1］。前期研究發現，長期的高鹽刺激可以通過張力應答性增強子結合蛋白（tonicityresponsive enhancer binding protein，TonEBP）/VEGFC/VEGFR-3信號通路引起自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）心肌間質淋巴管的增生，通過上調VEGF-C的表達在促進淋巴管明顯增生的同時，可使SHR血壓水平及左心室重塑程度得以改善［2］。而VEGFR-3+單核巨噬細胞是否參與了淋巴管生成的病理生理過程，目前尚不清楚。本研究利用流式分選技術將RAW264.7巨噬細胞中VEGFR-3+亞群分選出來，觀察高鹽刺激對VEGFR-3+單核巨噬細胞的表型、淋巴管內皮細胞特性及功能的影響，為進一步探討VEGFR-3+單核巨噬細胞亞群在高鹽誘導的高血壓靶器官損傷中的作用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小鼠RAW264.7巨噬細胞株由本實驗室提供；胎牛血清（FBS）、高糖培養基（DMEM）購自Gibco公司；Flt-4熒光標記的山羊抗小鼠VEGFR-3（VEGF-R3/Flt-4）抗體購自R&D Systems公司；TRIzol購自TAKARA公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green實時定量PCR試劑購自Roche公司；CCK-8購自碧云天公司；ABI 7300熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；流式細胞儀Cytomics FC 500和BD FACSAriaTMⅢ（Beckman Coulter公司）；Transwell購自 Costar公司；EZCellTMPhagocytosis Assay Kit購自Bio Vision公司；酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞分選VEGFR-3+巨噬細胞 將RAW264.7細胞置于含有10%FBS的高糖DMEM培養液中，5%CO2、37℃條件下，取對數生長期細胞用于實驗。計數后取1.0×107個細胞離心（1 000 r/min，5 min）棄上清，加1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2次；棄上清，分別加入VEGFR-3抗體75 μL，Staining Buffer 50 μL，PBS 70 μL，避光孵育 15 min，隨后以1.3 mL細胞染色緩沖液重懸細胞，上機檢測。根據表達的VEGFR-3的熒光強度不同可以將RAW264.7細胞分為兩群，應用Flow Jo 7.6.1軟件對流式數據進行分析，見圖1。

Fig.1 The gating strategy used for analysis of the VEGFR-3+macrophages圖1 VEGFR-3+巨噬細胞流式細胞分選的設門方法

1.2.2 Real-time PCR 將VEGFR-3+巨噬細胞按照每皿1.0×106濃度接種于10 cm培養皿中，培養3 h待細胞貼壁。分別設溶劑對照組（Control組），高鹽（high salt，HS，40 mmol NaCl）組，低鹽（low salt，LS，20 mmol NaCl）組，培養24 h，收取細胞后按照TRIzol說明書提取各組細胞總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，Real-time PCR檢測相關基因的mRNA表達水平。Real-time PCR反應條件：50℃2 min；95℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，30個循環。設3復孔，重復3次。2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達情況：ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因-Ct內參基因）-對照組（Ct目的基因-Ct內參基因）。檢測所用引物見表1。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活性 將對數生長期的VEGFR-3+巨噬細胞接種于96孔板（100 μL/孔，約5×103個細胞）按1.2.2中分組方法，每組設5復孔，重復3次。待細胞貼壁后，繼續培養24、48 h后，棄培養基，加入CCK-8溶液（10 μL/孔），孵育2～4 h后，使用酶標儀在450 nm處測定光密度（OD）值，細胞活力計算公式：細胞活力（%）=（加藥細胞OD-空白OD）/（對照細胞OD-空白OD）×100%。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移能力 選用8 μm孔徑的遷移小室，下室加入含10%血清的完全培養基600 μL，上室加200 μL（1×105個）無血清重懸的對數生長期細胞，按1.2.2中分組方法，置于37℃、5%CO2培養箱中分別培養24、48 h。將小室取出，觀察下室壁細胞數≥10個貼壁、伸展細胞，用蘸濕的棉簽將小室上表面細胞輕輕擦拭干凈后，在無水乙醇中固定10 min，0.4%臺盼藍染色30 min，1×PBS清洗。顯微鏡下對聚碳酸酯膜下表面的細胞進行計數。隨機讀取5個視野，計數每個視野細胞數目。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞吞噬能力 將對數生長期VEGFR-3+巨噬細胞接種于12孔板，按1.2.2中分組方法，待細胞干預至22 h和46 h，將細胞消化、離心，棄上清；每孔加入200 μL培養基，5 μL綠色酵母多糖（Green Zymosan）重懸，孵育2 h；再次離心、重懸，加入300 μL與干預時相同藥物濃度的吞噬作用測定緩沖液清洗3次，加入緩沖液1 mL上機。實驗重復3次。

Tab.1 The specific primer sequences of mononuclear macrophage in Real-time PCR表1 單核巨噬細胞Real-time PCR引物序列

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間多重比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高鹽對VEGFR-3+巨噬細胞表型及淋巴管內皮細胞特性的影響 與Control組相比，LS組、HS組的M1型巨噬細胞標志物TNF-α、CCL2、IL-1β mRNA表達水平顯著上調，代表M2型巨噬細胞標志物的Ym1、IL-10、Arg-1 mRNA表達水平減低（P＜0.05）；與Control組相比，HS、LS組的淋巴管標志物TonEBP、VEGF-C mRNA 表達水平上調（P＜0.05），Prox-1、LYVE-1、Podoplanin mRNA表達水平下調（P＜0.05）。與LS組相比，HS組的M1型巨噬細胞標志物TNF-α、IL-1β mRNA表達水平顯著上調（P＜0.05），HS組的淋巴管標志物 VEGF-C、TonEBP mRNA表達水平上調（P＜0.05）。高鹽刺激下VEGFR-3+巨噬細胞表現出促淋巴管內皮細胞生成的特性，但并未表現出淋巴管內皮細胞的特性，見表2。

2.2 高鹽刺激對VEGFR-3+巨噬細胞的活性的影響 與Control組、LS組相比，干預24、48 h，HS組的VEGFR-3+巨噬細胞的活性明顯降低（P＜0.05），見表3。

2.3 高鹽對VEGFR-3+巨噬細胞的遷移功能的影響 與Control組相比，干預24 h后，LS組、HS組VEGFR-3+巨噬細胞遷移能力均增強（P＜0.05）；與Control組相比，干預48 h后，HS組VEGFR-3+巨噬細胞遷移能力明顯增強（P＜0.05）；LS組與HS組相比差異無統計學意義，見圖2，表4。

Fig.2 ThemigrationabilityofdifferentgroupsbyTranswellassay（×200）圖2 Transwell實驗檢測各干預組細胞的遷移能力（×200）

Tab.2 The comparison of 24 h mRNA expression levels between three groups表2 各組細胞24 h mRNA表達水平的比較結果 （n=3,±s）

Tab.2 The comparison of 24 h mRNA expression levels between three groups表2 各組細胞24 h mRNA表達水平的比較結果 （n=3,±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F淋巴管標志物M1型巨噬細胞標志物TNF-α 1.00±0 1.63±0.13a 2.31±0.27ab 44.360＊＊CCL2 1.00±0 2.84±0.60a 4.15±1.14a 13.643＊＊IL-1β 1.00±0 1.97±0.03a 3.43±0.28ab 175.816＊＊M2型巨噬細胞標志物Ym1 1.00±0 0.13±0.08a 0.32±0.18a 48.367＊＊IL-10 1.00±0 0.23±0.13a 0.51±0.17a 28.468＊＊Arg-1 1.00±0 0.46±0.16a 0.47±0.33a 6.488＊VEGF-C 1.00±0 2.17±0.28a 3.10±0.57ab 25.057＊＊TonEBP 1.00±0 1.55±0.10a 2.16±0.05ab 261.575＊＊Prox-1 1.00±0 0.24±0.01a 0.68±0.10a 120.505＊＊LYVE-1 1.00±0 0.25±0.11a 0.46±0.22a 21.560＊＊Podoplanin 1.00±0 0.34±0.30a 0.37±0.43a 19.743＊＊

Tab.3 Comparison of the viability of VEGFR-3+cells between three groups表3 各組VEGFR-3+細胞的活性比較結果 （n=5,±s）

Tab.3 Comparison of the viability of VEGFR-3+cells between three groups表3 各組VEGFR-3+細胞的活性比較結果 （n=5,±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h 1.00±0 0.93±0.19 0.65±0.07ab 12.976＊＊48 h 1.00±0 0.71±0.05a 0.56±0.08ab 83.838＊＊

Tab.4 The migration ability of different groups by Transwell assay表4 Transwell檢測各干預組細胞的遷移能力（n=3,±s）

Tab.4 The migration ability of different groups by Transwell assay表4 Transwell檢測各干預組細胞的遷移能力（n=3,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與Control組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h細胞遷移數（個）251.00±2.65 265.11±6.38a 273.56±6.70a 12.618＊＊48 h細胞遷移數（個）261.00±4.62 271.44±8.44 282.00±4.84a 8.551＊

2.4 高鹽刺激對VEGFR-3+巨噬細胞吞噬能力的影響 與Control組相比，干預24、48 h后，HS組細胞的吞噬能力增強（P＜0.05）；與LS組相比，干預24、48 h，HS組細胞的吞噬能力增強（P＜0.05），見圖3，表5。

Tab.5 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry表5 流式細胞儀檢測各干預組細胞的吞噬能力（n=5，%，±s）

Tab.5 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry表5 流式細胞儀檢測各干預組細胞的吞噬能力（n=5，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較；b與LS組比較，P＜0.05

組別Control組LS組HS組F 24 h 4.42±1.03 5.12±1.69 9.10±1.94ab 12.472＊＊48 h 4.57±0.67 7.86±2.09a 11.50±2.03ab 20.115＊＊

3 討論

Fig.3 The phagocytosis ability of different groups by flow cytometry圖3 流式細胞儀檢測各干預組細胞的吞噬能力（n=5）

單核巨噬細胞主要來源于骨髓、外周血以及組織中。大量研究證實，單核巨噬細胞在表型和功能上存在異質性［3］。根據狀態功能不同巨噬細胞激活后分化為經典激活的巨噬細胞（classically activated macrophage，caMφ/M1型）及替代性激活的巨噬細胞（alternatively activated macrophage，aaMφ/M2 型）［4］。M1型巨噬細胞具有極強的抗原呈遞、促進炎癥反應的能力并產生大量炎性因子；M2型巨噬細胞具有抑制炎癥、改善組織修復進程的能力［5-6］。前期研究顯示，不同的單核細胞亞群其生理功能及病理作用存在差異，其中高鹽攝入能夠引起人外周血中間型單核細胞CD14+CD16+亞群數量及比例增加并伴隨炎癥相關因子表達上調、靶器官損傷［7-8］。本研究發現，VEGFR-3+巨噬細胞在高鹽刺激后向M1型巨噬細胞表型轉化，M2型巨噬細胞標志物基因表達水平減低，提示短期的高鹽刺激使VEGFR-3+巨噬細胞介導炎癥反應的功能增強。

近年來有研究發現，單核細胞具有多向分化潛能，在不同的誘導因素作用下可分化為不同的細胞，如T淋巴細胞、血管內皮細胞等；炎癥刺激下單核細胞有向淋巴管內皮細胞轉分化的可能性［9］。研究表明，外周血中有一部分幼稚單核細胞構成性的表達VEGFR-3［1］。單核細胞能夠在炎癥刺激下分泌VEGF-C，其與VEGFR-3結合刺激淋巴管內皮細胞增殖、遷移并促進淋巴管增生；也可通過形成細胞聚集體嵌入淋巴管壁直接參與新淋巴管內皮細胞的生成，稱為單核巨噬細胞的轉分化作用［1，10］。本研究利用流式細胞術將VEGFR-3+巨噬細胞分選出來，給予高鹽刺激后，發現其VEGF-C表達水平明顯增高，提示該群單核巨噬細胞在短期高鹽刺激下主要誘導淋巴管內皮細胞的增殖，與前述研究相一致，長期慢性高鹽刺激是否會誘導該群細胞轉分化為淋巴管內皮細胞，還需要進一步研究去證實。

由TonEBP誘導產生的VEGF-C是重要的促淋巴管生成因子。前期研究發現，長期的高鹽攝入可引起小鼠心肌單核巨噬細胞浸潤以及TonEBP/VEGF-C介導產生淋巴管，廣泛增生的淋巴管系統能夠調節高鹽誘導的血壓變化和水鹽代謝的平衡［11-13］。本研究顯示，短期的高鹽刺激引起VEGFR-3+巨噬細胞TonEBP和VEGF-C表達水平的顯著增加，與上述研究相一致；本研究結果提示在高鹽刺激下TonEBP/VEGF-C/VEGFR-3通路的激活可能在VEGFR-3+巨噬細胞轉分化作用中占有重要地位。

細胞的活性是其發揮免疫功能的基礎。巨噬細胞內各種因子的表達水平或活性的改變影響細胞增殖、吞噬、遷移、分泌細胞因子和趨化因子的能力，從而調節其免疫功能［14］。高鹽干預產生的高滲應激會引起細胞發生DNA斷裂等損傷性改變以及滲透壓保護性反應，這兩條相對的細胞信號通路間的平衡決定了細胞存活或凋亡［15］。高鹽產生的高滲狀態下，細胞活力明顯降低；鹽濃度降低，細胞活力增強。

在各種組織損傷的情況下，巨噬細胞需要進行增殖并向損傷區遷移，對外來異物或死亡宿主細胞進行吞噬。活化的巨噬細胞分泌的因子能調動其他粒細胞和淋巴細胞，共同促進局部及全身的炎癥反應，進而發揮抗原提呈的作用［16］。在參與機體炎癥反應的過程中，巨噬細胞的遷移功能是實現其參與炎癥反應的關鍵［17］。因此，高鹽干預下，觸發巨噬細胞釋放大量的炎癥因子，使其遷移細胞數量增多，遷移能力增強；吞噬率可直接反映其吞噬功能，高鹽干預下，細胞的吞噬能力增強，而低鹽狀態下則減弱［18］。

總之，本研究表明高鹽刺激使VEGFR-3+巨噬細胞向M1型巨噬細胞偏移，其吞噬及遷移能力明顯增強，并具有促淋巴管內皮細胞增殖的特性，為進一步研究該亞群與淋巴管生成及心血管疾病的關系提供了依據。