nm23-H1和P16蛋白在膀胱癌組織中的表達及其臨床意義

初桂偉，王利偉，趙 月，田春燕，李馥郁，蘇 楠，王連友

癌基因活化、抑癌基因突變或缺失、凋亡基因質或量改變為膀胱癌發生及發展的重要因素。故探析癌癥相關基因表達情況與膀胱癌的關系，對評估患者病情發展有利[1]。nm23-H1蛋白具有核苷二磷酸激酶活性，可通過影響微管解聚和G蛋白介導的信號傳導通路，而參與腫瘤發病與進展過程[2]。P16蛋白則為細胞周期調控通路的節點蛋白分子，可直接作用于細胞周期抑制細胞分裂，而作為重要的抑癌基因介導膀胱癌的發生發展[3]。基于此，本研究就膀胱癌組織及正常膀胱組織中nm23-H1和P16蛋白的表達情況展開分析，探討其在膀胱癌組織陽性表達率與患者臨床病理特征的關系，為臨床評估膀胱癌的發生發展提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年5月—2017年12月秦皇島市第四醫院和秦皇島市海港醫院行手術切除的124例膀胱癌組織標本作為膀胱癌組。①納入標準：均經病理證實為膀胱癌；臨床資料完整。②排除標準：有術前放化療史者；合并其他惡性腫瘤者。膀胱癌組男79例，女45例；年齡42～64(53.26±10.42)歲；腫瘤分級[4]：G1級56例，G2級39例，G3級29例；臨床分期[5]：Tis～T1期25例，T2～T3期79例，T4期20例。另收集59例正常膀胱組織標本作為正常組織組，其中男39例，女20例；年齡39～61(50.89±10.32)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測試劑與方法

1.2.1試劑：即用型鼠抗人nm23-H1單克隆抗體、鼠抗人P16單克隆抗體為一抗，生物素化羊抗鼠抗體為二抗，山羊正常血清、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)，均由福州邁新生物技術開發有限公司提供。

1.2.2免疫組織化學法：使用10%的甲醇固定標本，取2 cm×2 cm×2 cm體積的組織塊，利用石蠟常規包埋；應用乳酸處理載玻片，并將包埋的組織切成4 μm的薄片，貼附于處理后的載玻片上，烤箱烘烤6～10 h(設置溫度為50℃)。將烘烤后的組織進行脫蠟，醫用微波爐抗原修復3 min；并利用0.2%胰蛋白酶消化20 min，3%過氧化氫封閉10 min。用PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次；滴加山羊正常血清后送入恒溫水浴箱(37℃)保溫10 min。甩干殘留液，滴加鼠抗人nm23-H1或P16單克隆抗體，另取切片滴加PBS緩沖液及山羊正常血清作陰性對照，并利用醫用低溫冰箱(4℃)儲存12 h。置入振蕩器(PBS緩沖液)震蕩3次，5 min/次；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液10 min后，置入振蕩器震蕩3次，5 min/次。二氨基聯苯胺顯色5 min，蘇木素襯染3 min，鹽酸酒精分化、氨水反藍；由低向高濃度酒精脫水，二甲苯脫干后常規中性樹膠封片。

1.2.3染色結果判定：陽性為棕黃色或棕褐色顆粒狀，背景藍色；滴加PBS緩沖液及山羊正常血清為陰性。在高倍鏡(×200)下隨機選取10個視野，若陽性細胞表達數≥10%，則為陽性；若陽性細胞表達數<10%，則為陰性。

1.3觀察指標 ①比較膀胱癌組織及正常膀胱組織nm23-H1和P16蛋白的陽性表達率；②分析膀胱癌組織中nm23-H1和P16蛋白表達與患者臨床特征的關系。

1.4統計學方法 應用SPSS 19.0統計學軟件處理數據。計數資料以率(%)表示，應用χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1nm23-H1和P16蛋白的表達情況 膀胱癌組nm23-H1和P16蛋白陽性表達率均低于正常組織組(P<0.01)。見表1。nm23-H1陽性染色位于腫瘤細胞質內及核周，P16陽性染色位于腫瘤細胞核內。見圖1～4。

表1 膀胱癌及正常膀胱組織中nm23-H1和P16蛋白的表達情況[例(%)]

圖1 正常膀胱組織nm23-H1染色(SABC染色 ×200) 圖2 膀胱移行細胞癌nm23-H1染色(SABC染色 ×200) 圖3 正常膀胱組織P16染色(SABC染色 ×200) 圖4 膀胱移行細胞癌P16染色(SABC染色 ×200)

2.2膀胱癌組織nm23-H1蛋白表達與臨床病理特征的關系 膀胱癌組織nm23-H1蛋白表達與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤個數無關(P>0.05)，而與腫瘤分級、臨床分期有關，且其陽性表達率隨腫瘤分級及臨床分期的升高而降低(P<0.01)。見表2。

2.3膀胱癌組織P16蛋白表達與臨床病理特征的關系 膀胱癌組織P16蛋白表達與性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤個數無關(P>0.05)，而與腫瘤分級、臨床分期有關，且其陽性表達率隨腫瘤分級及臨床分期的升高而降低(P<0.01)。見表3。

3 討論

近年來，分子生物學研究的發展為惡性腫瘤的診斷提供新方向，但相關促癌基因與抑癌基因參與膀胱癌發生、發展的作用機制尚未闡明[6]。然而，大量證據顯示，抑癌基因的失活為腫瘤細胞增殖、分化過程中的重要環節[7]。故探究相關抑癌基因在膀胱癌組織中的表達情況，對評估膀胱癌患者的病情進展有積極意義。

nm23-H1為nm基因的等位基因之一，由5個外顯子及4個內含子構成，編碼區有533個核苷酸，具有核苷二磷酸激酶、組氨酸蛋白激酶活性，也可使絲氨酸自身磷酸化[8]。且據文獻報道，nm23-H1通過以下個3個途徑參與腫瘤的發生與發展：①參與微管的聚合及降解，微管是維持細胞形態和減數分裂時紡錘體組成結構的一種微絲蛋白，在微管聚合異常時，癌細胞染色體非整倍體形成，而影響腫瘤進展[9]；②參與蛋白介導的信號傳遞，nm23-H1可編碼二磷酸激酶的A鏈，使信號傳導過程中的二磷酸鳥苷還原為三磷酸鳥苷，而激活G蛋白，介導細胞發育及腫瘤發展[10]；③影響細胞骨架，促進細胞運動，進而參與腫瘤細胞的浸潤過程[11]。本研究結果也顯示，膀胱癌組織中nm23-H1蛋白陽性表達率明顯低于正常膀胱組織。提示nm23-H1在抑制膀胱癌發生過程中具有一定作用，此結果也與外國的研究結果一致[12]。

還有研究顯示，nm23-H1在腫瘤形成的初始階段高表達，而在發生腫瘤轉移時則降低，說明nm23-H1與癌細胞向惡性方向發展有限制作用[13]。本研究結果還顯示，膀胱癌組織中nm23-H1蛋白的陽性表達率隨患者腫瘤分級及臨床分期的升高而降低。這也證實nm23-H1為膀胱癌細胞增殖及分化的抑制基因，當組織中含一定量的nm23-H1可抑制細胞轉化，并減少細胞分化；而在nm23-H1發生基因丟失、突變時，可使細胞轉化、惡性度增加。

另外，P16由3個外顯子及2個內含子構成，具有抑制細胞周期依賴蛋白激酶4(CDK4)活性的作用[14]。而細胞增殖分化的重要通路為細胞周期，細胞周期又與CDK4的活性表達及調控密切相關，CDK4活化后可促進細胞分裂由G1期進入S期，以加速細胞增殖[15]。因此，P16可通過抑制CDK4活性而阻止腫瘤細胞增殖，具有延緩腫瘤進展的作用。本研究結果也表明，膀胱癌組織中P16蛋白陽性表達率明顯低于正常膀胱組織，且其陽性表達率隨患者腫瘤分級及臨床分期的升高而降低。說明P16的缺失及突變能引起CDK4的活性增強，使腫瘤細胞增殖不受限制，而促進膀胱癌惡性進展。既往也有大量研究顯示，P16對食管癌、胃癌等惡性腫瘤的發生和發展有抑制作用，檢測其在組織中的表達情況對預測腫瘤的進展有積極作用[16-17]。

表2 膀胱癌組織nm23-H1蛋白表達與臨床病理特征的關系[例(%)]

表3 膀胱癌組織P16蛋白表達與臨床病理特征的關系[例(%)]

綜上所述，nm23-H1及P16蛋白在膀胱癌組織中表達降低，且其陽性表達率隨患者腫瘤分級及臨床分期升高而降低，檢測其表達情況對預測膀胱癌的惡性進程有積極意義。