益氣養陰祛瘀方藥對特發性肺纖維化大鼠氧化損傷的影響

支 政，邱 剛，趙 靜，方 芳，楊麗蕓，方朝義

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)發病原因復雜，病變以彌漫性肺泡炎、肺纖維化為主。其常見臨床表現為進行性呼吸困難，活動后加重，常伴有咳嗽、胸悶等癥狀。IPF好發于中老年人群，預后較差，5年生存率為30%～50%，且其發病率和病死率逐年升高。而目前IPF的發病機制尚未明確，臨床上缺少有效的治療手段，給患者生命健康造成嚴重威脅[1-4]。從中醫的角度而言IPF屬于“肺痿”范疇，結合古代醫家對肺痿的認識，“肺虛絡瘀”是IPF的核心病機[5-6]。故本研究以益氣養陰祛瘀為治法組方，探究IPF對機體所造成氧化損傷的特征以及益氣養陰祛瘀方藥的作用機理，為臨床上中醫藥治療IPF奠定理論基礎，現將具體內容報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級wistar大鼠135只，雌雄各半，體質量(200±20)g，鼠齡10～12周，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供，合格證號：0015045，許可證號：SCXK(鄂)2004-2007。

1.2藥品和試劑 博來霉素(日本化藥株式會社，進口許可證號：X20000349)；醋酸潑尼松片(河南永和制藥公司，批號：H41024247)。益氣養陰祛瘀方藥：黃芪、麥冬、丹參、銀杏、太子參、百合、地龍、虎杖，按照3∶1.5∶1.8∶1∶1.5∶1∶1∶1.5的比例，調配成藥，常規水煎。丙二醛(MDA)檢測試劑盒(20051211)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(20051209)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3主要儀器與設備 AE200電子分析天平(梅特勒-多利托儀器上海有限公司)，TDL-5A型離心機、MSE-25型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，LEICARMZ135石蠟切片機(德國萊卡公司)，SFC-182型生物顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)，GL-88B型旋渦混勻器(江蘇海門其林醫用儀器廠)，電動勻漿器(52954部隊電器廠)，WD4060超低溫冰箱(冠森生物科技上海公司)，HH-W21-cr600電熱恒溫水箱(北京長安科學儀器)。

1.4分組及給藥 將135只Wistar大鼠常規飼養3 d后，稱重，并根據體質量隨機分為對照組、模型組、高劑量組、低劑量組和強的松組，各27只。造模后第2天給予對照組和模型組生理鹽水10 ml/kg灌胃，高劑量組和低劑量組分別給予等量的2.46 g/ml和1.23 g/ml益氣養陰祛瘀方藥混懸液灌胃，強的松組給予等量的0.6 mg/ml強的松灌胃，均為每日1次。每組大鼠又根據給藥時間不同分為3個亞組，每組9只，分別于給藥7 d、14 d和28 d時處死大鼠進行觀察。

1.5造模方法 按照參考文獻[7-9]的方法復制IPF大鼠模型，腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg，待大鼠麻醉后，固定于30°傾斜鼠板，將7號無菌針頭插入氣管，插管成功后，對照組給予氣管內滴注生理鹽水5 ml/kg，模型組、高劑量組、低劑量組、強的松組大鼠氣管內滴注博來霉素0.2 ml(按體質量5 mg/kg給藥)，滴注完畢后將大鼠直立，左右旋轉約1 min，使藥液均勻分布于雙肺，完畢后縫合皮膚，待大鼠自然清醒后進行常規飼養。

1.6觀察指標及檢測方法 ①一般情況：每日觀察各組大鼠飲食狀態、呼吸情況、活動力、反應靈敏度、皮毛光澤度等。②MDA含量和SOD活力檢測：分別選取各組大鼠血清和肺組織，利用硫代巴比妥酸比色法測定MDA，利用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。③肺組織病理改變：各組大鼠麻醉后，取右葉肺組織，經4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，常規HE、Masson染色，在光鏡下觀察。

2 結果

2.1一般情況 對照組大鼠飲食如常，毛發光亮，反應靈敏，呼吸平穩，體質量呈上升趨勢。模型組大鼠出現呼吸困難，食欲不振，反應遲鈍，身體蜷曲，大便干燥，小便量少，皮毛枯槁，多呈倒豎狀。高劑量組與低劑量組大鼠狀態隨著時間的增加逐漸好轉，活動弱于對照組而強于模型組，飲食逐漸恢復，皮毛光亮，呼吸平穩。強的松組大鼠狀態隨時間增加亦呈現好轉趨勢。給藥7 d的低劑量組和強的松組各死亡1只，給藥14 d的模型組、高劑量組、低劑量組和強的松組各死亡1只，給藥28 d的模型組和高劑量組各死亡2只，給藥28 d的低劑量組和強的松組各死亡1只。

2.2血清和肺組織的MDA含量比較 給藥7、14和28 d，模型組的血清和肺組織MDA含量均高于對照組(P<0.05)，高劑量組和強的松組的血清MDA含量均低于模型組(P<0.05)，高劑量組的肺組織MDA含量低于模型組(P<0.05)。給藥7和28 d，低劑量組和強的松組肺組織的MDA含量低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清和肺組織的丙二醛含量比較

2.3血清和肺組織的SOD活力比較 給藥7、14和28 d，模型組的血清SOD活力低于對照組(P<0.05)，高劑量組高于模型組(P<0.05)。給藥14和28 d，低劑量組的血清SOD活力高于模型組(P<0.05)，高劑量組高于強的松組(P<0.05)。給藥7 d，強的松組的血清SOD活力高于模型組(P<0.05)。給藥28 d，低劑量組的血清SOD活力高于強的松組(P<0.05)。給藥7和14 d，模型組的肺組織SOD活力低于對照組(P<0.05)，高劑量組、低劑量組和強的松組高于模型組(P<0.05)。給藥14 d，高劑量組的肺組織SOD活力高于強的松組(P<0.05)。見表2。

2.4肺組織外觀形態變化 對照組雙肺組織結構清晰，表面光滑、色紅、具有良好彈性。模型組給藥7 d時雙肺可見散在出血點，出現灶狀瘀斑，體積增大；給藥14 d時雙肺邊緣有點狀出血，色灰白，局部見不同程度的結節樣改變，部分肺葉體積縮小；給藥28 d時雙肺色蒼白，質地變硬，彈性降低。高劑量組、低劑量組及強的松組雙肺色暗紅，局部體積縮小，可見不同程度的結節樣改變，偶見散在出血點。

2.5肺組織病理變化 對照組雙肺結構清晰，未出現炎癥及水腫現象，給藥7、14和28 d時均未見病理改變。模型組給藥7 d時肺泡間隔增寬，肺間質彌漫性炎性細胞浸潤；給藥14 d時肺間質炎性細胞浸潤程度降低，肺泡間隔明顯增寬增厚，成纖維細胞增生；給藥28 d時肺纖維化程度嚴重，肺泡結構萎縮甚至消失。高、低劑量組及強地松組肺泡間隔增寬，炎性細胞浸潤程度低于模型組，成纖維細胞少量增殖。其中高劑量組炎性細胞浸潤及肺纖維化程度最輕。見圖1～4。

表2 各組大鼠血清和肺組織的超氧化歧化酶活力比較

圖1 各組大鼠給藥14 d的肺組織形態學改變(HE ×100)

圖2 各組大鼠給藥14 d的肺組織形態學改變(HE ×400)

圖3 各組大鼠給藥28 d的肺組織形態學改變(Masson ×100)

3 討論

IPF的發病機制尚未明確，其主要病理改變為肺纖維化，危害嚴重，最終可導致患者因呼吸衰竭而死亡[10-11]。IPF的發病率逐年升高，且預后情況較差，給患者的生命健康造成嚴重威脅[12-13]。臨床常應用抗生素及免疫抑制劑治療IPF，而治療效果并不明顯[14-15]。近年來，許多中醫臨床研究者認為“血瘀內阻”為形成肺痿的核心，利用益氣養陰祛瘀方藥治療IPF取得了一定的效果[16-18]。但仍缺乏系統的研究，故本研究旨在探討IPF狀態下機體氧化損傷的特點和益氣養陰祛瘀方藥的作用機理。

受到良好控制的自由基會維持機體的生命活力，然而自由基失去控制后，會對機體造成不良影響。研究表明，自由基損傷存在于多種疾病過程中，機體經酶系統和非酶系統產生氧自由基，而氧自由基具有過氧化殺傷作用，可形成酮基、羥基等多種脂質過氧化物，過多的氧自由基會導致多種疾病發生。MDA是氧自由基在生物膜中攻擊多不飽和脂肪酸所形成的最終產物，會導致生物體內的大分子物質如蛋白質、核酸聚合，且具有細胞毒性。故可通過測定MDA含量的變化評價機體脂質過氧化的程度，從而了解組織細胞氧化損傷程度。MDA含量越高，表明機體脂質過氧化程度越高，病情越嚴重。本研究模型組血清和肺組織MDA含量顯著高于對照組。說明機體脂質過氧化程度增加，導致清除過量氧自由基能力減弱，機體耗氧量顯著增加，產生大量氧自由基。脂質過氧化程度的增加導致MDA含量的升高，提示氧化損傷在IPF的發生發展過程中起重要作用。

SOD是存在于人體正常組織中可清除氧自由基的酶系統，具有抗衰老的作用[19]。SOD活性越高，清除氧自由基的能力就越強，故SOD活力水平可反映機體抗氧化能力的強弱。IPF大鼠前期SOD功能受到抑制，肺臟為自我保護從而消耗SOD，本實驗中模型組給藥7和14 d時肺組織中SOD活力水平明顯低于對照組驗證了這一觀點。本研究發現，益氣養陰祛瘀方藥對提高SOD活力水平起到了促進作用，具有降低脂質過氧化反應，減輕氧自由基損傷從而保護肺組織的作用。

綜上所述，益氣養陰祛瘀方藥具有降低MDA含量，提高SOD活力水平，降低脂質過氧化反應的作用。故益氣養陰祛瘀方藥可有效減輕肺組織氧化損傷及肺纖維化程度，在臨床IPF的治療方面發揮重要作用。