Jagged 1在輻射誘導(dǎo)肺纖維化中的作用

來志揚(yáng),魏仲航

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.放射線科；2.急救醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

Jagged1(JAG1)可以調(diào)節(jié)諸多細(xì)胞表型，并在輻射誘導(dǎo)的肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用，在肺損傷發(fā)展過程中，血管周圍成纖維細(xì)胞中的Notch被激活，激活的Notch可與JAG1結(jié)合，并抑制肺組織正常的損傷修復(fù)過程，從而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。放射性肺纖維化是放射治療最為棘手的并發(fā)癥之一。如何減少放射性肺纖維化的發(fā)生、減輕肺纖維化程度，以增強(qiáng)放療的效果已經(jīng)成為腫瘤放射治療的一個(gè)熱點(diǎn)。了解掌握J(rèn)AG1在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，對(duì)防治肺纖維化，減少并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。本文對(duì)JAG1在放射性肺纖維化中作用的分子機(jī)制及治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

哺乳動(dòng)物有4種Notch受體(Notch1-4)和5種Notch配體(Delta-like1/3/4，Jagged1/2)。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY等堿性螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用[1-3]。

肺部受到輻照或化學(xué)藥物損傷過程中，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的少量基質(zhì)可以促進(jìn)損傷修復(fù)，但當(dāng)產(chǎn)生基質(zhì)過多的時(shí)候，就可以形成瘢痕或纖維化。所以成纖維細(xì)胞是纖維化形成過程中的核心細(xì)胞[4,5]，在肺損傷修復(fù)過程中同樣發(fā)揮至關(guān)重要作用。Notch-JAG1主要作用是調(diào)節(jié)肺細(xì)胞的表型，從而發(fā)揮生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞，所以Notch-JAG1可能在肺成纖維細(xì)胞中也有調(diào)控作用[6,7]。

1 材料與方法

1.1材料人肺成纖維細(xì)胞系HLF購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco；siRNA-JAD1購于中國蘇州吉瑪基因。α-SMA、Collagen-1、JAG1單克隆抗體購于美國Abcam；MTT試劑盒購于博士德生物有限公司。

1.2細(xì)胞分組常規(guī)復(fù)蘇HLF細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含有1%雙抗+10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HLF細(xì)胞并接種于4個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞融合率為50%左右，分為4組，即對(duì)照組(control)、照射組(IR)、siRNA抑制組(siRNA-JAG1)、抑制+照射組(siRNA+IR)，抑制組和抑制+照射組轉(zhuǎn)染siRNA-JAG1，轉(zhuǎn)染后24 h，照射組與抑制+照射組進(jìn)行10Gy X-Ray輻照隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3蛋白表達(dá)檢測(cè)

收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，測(cè)定每組蛋白濃度，取適量樣品行Western Blot凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，將膜置于10%牛奶的封閉液中，室溫封閉2 h，分別加入α-SMA、Collagen-1、JAG1單克隆抗體(1∶1 000)置于4℃過夜，二抗(1∶10 000)室溫2 h，按ECL試劑盒說明進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.4mRNA水平檢測(cè)

收集各組細(xì)胞并提取總RNA，測(cè)定每組RNA濃度，用takala逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照常規(guī)實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，得到的cq值通過統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終以△△CT形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析做圖。

1.5細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，離心棄掉上清液每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，持續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO每孔100 μl，震蕩至結(jié)晶物充分溶解，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值(OD值)并做圖統(tǒng)計(jì)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組數(shù)據(jù)間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成纖維細(xì)胞輻照后JAG1及肺纖維化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況

為確定JAG1是否與輻射誘導(dǎo)的纖維化相關(guān)，我們檢測(cè)了HLF細(xì)胞輻照后24 h、48 h、72 h后，JAG1、α-SMA、Collagen-1的蛋白和mRNA表達(dá)情況。通過以上檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)輻照后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，JAG1蛋白表達(dá)逐漸增高與mRNA表達(dá)一致，(P<0.05)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1A、B)。與此同時(shí)平滑肌動(dòng)蛋白α-SMA和膠原蛋白1(Collagen-1)的蛋白與mRNA表達(dá)也升高(P<0.05)，與JAG1形成正相關(guān)。

(1A為Western Blot法檢測(cè)結(jié)果；1B為qPCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

2.2抑制成纖維細(xì)胞中的JAG1可抑制肺纖維化

為確定是否抑制JAG1可抑制輻射效應(yīng)減弱肺纖維化，我們首先設(shè)計(jì)了JAG1基因的干擾片段(siRNA-JAG1),在三個(gè)干擾片段中，通過蛋白和mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)我們選取了干擾效果最好的siJAG1-1片段(見圖2A、B)。在成纖維細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JAD1的干擾片段24 h后對(duì)其進(jìn)行10Gy的X射線輻照，結(jié)果顯示，與單獨(dú)輻照組相比，轉(zhuǎn)染+照射組α-SMA表達(dá)顯著下降，說明成纖維細(xì)胞并未被激活，沒有向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Collagen-1的表達(dá)同樣明顯被抑制，說明JAG1的抑制會(huì)減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度堆積，從而緩解纖維化。

注：*P<0.05，與Control組相比較；#P<0.05，與10 Gy組相比較

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，輻照后細(xì)胞增殖活性顯著降低，轉(zhuǎn)染siJAG1-1后，活性明顯增強(qiáng)，說明抑制JAG1后可顯著提升成纖維細(xì)胞對(duì)X射線的輻射抗性，降低輻射對(duì)其影響(見圖3)。

圖3 各組細(xì)胞增殖活性比較

3 討論

近年來關(guān)于JAG1的研究主要集中在血液腫瘤方面，關(guān)于JAG1基因在肺纖維化中的研究鮮為人知。JAG1與Notch的結(jié)合可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表型從而發(fā)揮生物學(xué)功能。同時(shí)JAG1可影響多條信號(hào)通路如TGF-β/Smads，Wnt/β-catenin，以及PI3K/AKT信號(hào)通路等[8-10]，這些信號(hào)通路多數(shù)均參與肺纖維化進(jìn)程中的一部分。

我們目前的研究表明，JAG1的蛋白與肺纖維化重要標(biāo)志物之間是負(fù)相關(guān)的。體外研究中發(fā)現(xiàn)，隨著輻照后時(shí)間的延長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA逐漸表達(dá)增強(qiáng)，表明輻照后成纖維細(xì)胞被活化，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。隨后我們檢測(cè)了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的主要成分Collagen-1，結(jié)果表明輻照后Collagen-1同樣呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，表明ECM大量集聚，最終產(chǎn)生了纖維化(見圖1)[12]。前期實(shí)驗(yàn)證明JAG1與肺纖維化重要標(biāo)志物呈正相關(guān)，說明JAG1參與到輻射誘導(dǎo)的肺纖維化過程中，為研究JAG1在肺纖維化中的具體作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了JAG1的小分子RNA干擾片段，實(shí)驗(yàn)證明干擾效果良好。隨后我們對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了JAG1的抑制，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JAD1被抑制后肺纖維化標(biāo)志物α-SMA、Collagen-1同樣被抑制。同時(shí)，JAG1抑制后可明顯降低輻射誘導(dǎo)的纖維化標(biāo)志物的升高(見圖2)，說明JAG1在肺纖維發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用，抑制JAG1可降低輻射效應(yīng)，提高成纖維細(xì)胞的輻射抗性，阻止成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并阻止ECM的聚集，從而緩解纖維化。接下來，為研究JAG1的降低是否對(duì)輻射導(dǎo)致成纖維細(xì)胞損傷產(chǎn)生影響，我們利用JAG1低表達(dá)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行輻照，檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，輻照可導(dǎo)致細(xì)胞損傷降低成纖維細(xì)胞增殖活性，而抑制JAG1后，成纖維細(xì)胞增殖活性顯著上升，表明JAG1可緩解輻射損傷，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的輻射抗性。至此我們得出結(jié)論，JAG1參與輻射誘導(dǎo)的肺纖維化過程，并且抑制JAG1可顯著降低輻射誘導(dǎo)的肺纖維化降低輻射對(duì)成纖維細(xì)胞的損傷。

綜上所述，抑制JAG1可調(diào)控肺纖維化過程，并降低輻射對(duì)成纖維細(xì)胞的損傷。但實(shí)驗(yàn)仍有不足，輻照后成纖維細(xì)胞中JAG1是否會(huì)通過其他下游靶基因參與肺纖維化過程仍有待進(jìn)一步深入研究。