Vinculin在大腸癌及腎癌中的表達及意義

鄭 巖，鄢 超，孫景春，趙文波，何成彥，方 玲

(吉林大學中日聯誼醫院 1.檢驗科；2.門診部，吉林 長春130033)

大腸癌(CRC)是全球常見的惡性腫瘤之一，包括結腸癌和直腸癌，具有很高的死亡率。根據世界衛生組織調查研究，新診斷為大腸癌的患者數量增加77%，預計到2030年大腸癌的死亡病例數會增加80%[1]。腎癌(RCC)是最致命的泌尿生殖系統癌癥之一，且呈年輕化趨勢，約占人類惡性腫瘤的3%[2]。因此，了解大腸癌和腎癌的發生發展過程對于其防治及預后至關重要。 Vinculin(紐蛋白)是一種細胞骨架蛋白，集中在鈣粘附蛋白介導的細胞-細胞連接處的胞質表面及整合素介導的細胞-細胞外基質的粘著斑部位，在細胞內高度保守[3]。 現已證實，vinculin通過VCL基因頭部(Vh)和尾部(Vt)相互作用調節細胞擴散、連接及黏附功能[4]。因vinculin可增強細胞粘附性，故將其認為是細胞遷移的抑制劑，而癌癥的侵襲性和轉移性與細胞-細胞、細胞-細胞外基質的粘附性密切相關[5]。本文應用二維液相色譜-質譜聯用技術和免疫印跡技術研究 vinculin在大腸癌及腎癌組織中的表達情況，旨在探討 vinculin與大腸癌、腎癌發生發展的聯系。

1 材料與方法

1.1 組織來源

本實驗所用的20例大腸癌組織、18例腎癌組織均來自吉林大學中日聯誼醫院經外科手術切除的標本，經病理學檢查證實大腸癌標本均為DukesB期腺癌，腎癌標本均為透明細胞腎癌。手術前均經患者同意且確定沒有接受任何治療。所取的大腸癌癌旁標本均為位于癌組織上端距離癌邊緣10 cm之外的組織。標本離體后，立即用生理鹽水沖洗干凈，液氮凍存備用。

1.2 主要試劑與儀器

二硫代蘇糖醇(DTT)、測序級TPCK修飾的胰蛋白酶為美國GE公司產品；2-碘乙酰胺(IAM)、BCA蛋白定量試劑盒、尿素(Urea)為Bio-Rad公司產品；PMSF、TMED、SDS、DNA酶和RNA酶為美國Sigma公司產品；LTQXL線性離子阱質譜儀為ThermoFisher公司產品，1200納升級液相色譜分析儀購于Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1組織總蛋白提取并測定濃度 取出凍存的組織樣本，充分研磨成粉末。加入裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCL，9 mol/L Urea，65 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF)，室溫振蕩1h，充分溶解混合物，用RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA，4℃離心50 min后留取上清，即為總蛋白質。考馬斯亮藍法染色，以不同濃度的標準蛋白和595 nm處測得的吸光度繪制標準曲線，計算出樣本蛋白濃度。

1.3.2組織樣品蛋白分離及制備水解多肽混合物 對各樣本組織的總蛋白進行電泳分離，為降低所得組織蛋白的尿素濃度，用25 mmol/L NH4HCO3進行清洗。加入一定體積1 mol/L的DTT，56℃避光放置1 h。待反應物降至室溫，再加入1 mol/L的2-碘乙酰胺(IAM)，室溫下避光反應30 min。按1∶50比例加入測序級TPCK修飾的胰蛋白酶和待測蛋白37℃酶切過夜，真空抽干所得樣品，置于-80℃冰箱。

1.3.3液質聯用技術分析分離鑒定多肽混合物 用Buffer A溶解所得樣本，各取50 μg色譜上樣，進行反向色譜洗脫。將洗脫的多肽運用LTQXL離子肼質譜儀分析，再用數據依賴的方式進行質譜掃描。

1.3.4免疫印跡試驗 用免疫印跡試驗再次測定目標蛋白vinculin，驗證其在各樣本組織中的表達情況。vinculin單克隆抗體為美國Abgent公司產品，內參抗體為β-Actin。

1.4 統計學分析 使用SPSS11.0軟件對所得的液質聯用圖譜進行t檢驗分析，算法依據SEQUEST法，P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二維液相色譜-質譜聯用技術分析結果

本實驗對于有豐度變化的蛋白質判定標準為：其質譜數在配對樣品中的比值≥1且差值≥72。通過二維液相色譜-質譜聯用技術對大腸癌組織及癌旁組織、腎癌組織及癌旁組織的總蛋白分析測定，得出目標蛋白vinculin在大腸癌組織中表達水平明顯下調，而在腎癌組織中為上調表達，vinculin質譜結果見圖1。

圖1 Vinculin質譜圖

2.2 免疫印跡驗證vinculin的表達情況

用Western blot檢測各組織中vinculin的表達水平。結果證明vinculin在大腸癌中的表達水平明顯低于配對的癌旁組織，結果見圖2；而腎癌組織中vinculin的表達水平高于配對的癌旁組織，結果見圖3。進一步的驗證了二維液相色譜-質譜聯用技術的鑒定結果。

圖2大腸癌中Vinculin免疫印跡圖圖3腎癌中Vinculin免疫印跡圖

3 討論

蛋白質組學(proteomics)技術于20世紀90年代發展起來，具有與以往不同的研究思路,其著眼點為目標對象的總蛋白水平,測定分析樣本中的差異蛋白，對初步篩選與腫瘤細胞轉移相關的蛋白質有著重要作用，也為腫瘤細胞浸潤轉移方面研究提供新的啟示[6,7]。本實驗使用的質譜技術是目前蛋白質組學中研究最熱，最有價值的技術。

癌癥進展中最關鍵的步驟之一是腫瘤細胞獲得侵入基底膜并進入周圍組織的能力，這與癌癥轉移擴散和最終死亡相關。在這個過程中，腫瘤細胞通常重組他們的肌動蛋白細胞骨架并改變其細胞形狀[8]。vinculin作為粘著斑的一個組成蛋白，對肌動蛋白重組和細胞黏附有一定的調控作用，當運用siRNA干擾法對vinculin的表達進行阻斷時，可觀察到細胞遷移顯著增加[9]。有研究表明，紐蛋白影響細胞擴散及肌動蛋白重組的機制是由VCL磷酸化造成的，而這種磷酸化則是SRC 激酶激發引起[10]。Rothenberg KE等人運用新的FRET-FRAP技術研究發現，紐蛋白通過與Talin或肌動蛋白多種結合形式引起不同的機械狀態，進而調節粘著斑的細胞及組織力學敏感性，增強力的傳遞或重排能力[11]。目前，對vinculin在腫瘤發生發展中的作用研究頗熱,多篇報道指出在多種類型癌癥中vinculin上調表達。Jin GH證實，VCL的基因表達值在胃癌組織中顯著上調，表明vinculin可能通過促進腫瘤惡性度和侵襲性參與胃癌進展[12]；Ai J等發現，在前列腺癌中vinculin也高度表達，預示著部分患者將從VCL基因的敲低中受益[13]。還有一些研究顯示，在鱗狀細胞癌、腎癌、膀胱癌等類型腫瘤中均上調表達vinculin。但并非所有類型癌組織中vinculin均為高表達。研究表明，Vinculin在大腸癌組織中低表達，且與膜結合β-catenin 成正相關，缺乏紐蛋白表達可作為大腸癌患者的獨立預后因素[14]。

本研究運用液質聯用技術證實了vinculin在大腸癌組織中的表達水平明顯低于其癌旁組織，而在腎癌組織中的表達卻顯著高于其癌旁組織，并通過免疫印跡技術得到證實。雖然多種腫瘤疾病中vinculin的表達情況有所不同，但這同時證明vinculin與腫瘤的發生發展過程有關，具體機制目前尚未完全明確，仍需進一步深入探究。