陰炎凈洗液對大鼠接觸性皮炎濕疹的抗炎作用及其分子機制研究

譚謙　歐陽波　肖作奇

[摘要] 目的 探究陰炎凈洗液對大鼠接觸性皮炎濕疹（ACD）的抗炎作用及其分子機制。 方法 將50只雌雄各半的SPF級SD大鼠按隨機數字表法分為五組，分別為空白對照組（純化水50 μL）、ACD模型組（純化水50 μL）、陽性對照組（地塞米松磷酸鈉注射液50 μL）、低劑量治療組（陰炎凈洗液50 μL）和高劑量治療組（2倍濃縮陰炎凈洗液50 μL），每組10只，每天相應藥物涂抹右耳2次，給藥10 d。觀察皮膚變應性反應和腫脹度，利用免疫組織化學法和蛋白免疫印跡實驗檢測磷酸化細胞外調節蛋白激酶（pERK1/2）和核因子κB（NF-κB）的表達水平。 結果 與空白對照組比較，ACD模型組大鼠耳腫脹度明顯升高（P < 0.01）。與ACD模型組比較，高劑量治療組和低劑量治療組的耳腫脹度均明顯降低（P < 0.01）。與空白對照組比較，ACD模型組大鼠耳組織中pERK1/2和NF-κB的蛋白表達明顯升高（P < 0.01）。與ACD模型組比較，高劑量治療組和低劑量治療組的pERK1/2和NF-κB的蛋白表達均明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 陰炎凈洗液對ACD大鼠有抗炎作用，其機制可能是依賴于對pERK1/2/NF-κB信號通路的抑制作用。

[關鍵詞] 陰炎凈；接觸性皮炎；核因子κB通路；pERK1/2

[中圖分類號] R758.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（c）-0013-04

Study of anti-inflammatory effect and molecular mechanism of Yinyanjing Lotion

TAN Qian OUYANG Bo XIAO Zuoqi

Department of Pharmaceutical Preparation， Hu′nan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To investigate anti-inflammatory effect and molecular mechanism of Yinyanjing Lotion on allergic contact dermatitis （ACD） rats. Methods Fifty half male and half female SPF grade SD rats were randomly divided into 5 groups according to random number table method， including blank control group （purified water 50 μL）， ACD model group （purified water 50 μL）， positive control group （Dexamethasone Sodium Phosphate Injection 50 μL）， low dose treatment group （Yinyanjing Lotion 50 μL） and high dose treatment group （2 times concentrated Yinyanjing Lotion 50 μL）， with 10 rats in each group. The right ears were smeared with drugs twice a day for 10 days. The allergic reaction and swelling degree of the skin were observed， and the expression levels of phosphorylated extracellular regulated protein kinases （pERK1/2） and nuclear factor κB （NF-κB） were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with the blank control group， the ear swelling degree of rats in the ACD model group was significantly increased （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the ear swelling degree of rats in the high dose treatment group and low dose treatment group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the protein expression of pERK1/2 and NF-κB in the ACD model group was significantly up-regulated （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the protein expression of pERK1/2 and NF-κB in the high dose treatment group and low dose treatment group was significantly down-regulated （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Yinyanjing Lotion has an anti-inflammatory effect on ACD rats， and the mechanism may be achieved by inhibition of pERK1/2/NF-κB signaling pathway.

[Key words] Yinyanjing； Allergic contact dermatitis； Nuclear factor-κB pathway； pERK1/2

陰炎凈洗液（以下簡稱“陰炎凈”）作為湖南省婦幼保健院（以下簡稱“我院”）的醫療制劑被廣泛用于陰道炎、盆腔炎等婦科炎癥的預防和治療，近年來該制劑也在兒科用于濕疹、皮炎等皮膚炎癥的治療[1]。基于對陰炎凈在接觸性皮炎濕疹（ACD）治療過程中的前期研究，我們發現對于2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘發的ACD大鼠[2]，陰炎凈有顯著的治療作用，經過陰炎凈治療的大鼠背部皮膚的腫脹度明顯降低，且研究結果表明陰炎凈的抗炎活性強度與有效成分的濃度呈正相關[3]。對陰炎凈抗炎機制的探究，已經初步確定該制劑能引起ACD大鼠血清中的白細胞介素（IL）-2、IL-4和γ干擾素（IFN-γ）濃度顯著降低，但是引起這一生理變化的分子機制尚不明確。而在許多的炎癥動物實驗研究中報道了NF-κB的信號通路在炎性反應和自身免疫反應中的調節作用[4]。例如在鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）誘導的ACD小鼠上，NF-κB信號通路被激活，從而加重了炎性反應[5]。核因子κB（NF-κB）的激活被認為是引起細胞應激反應的一部分，繼而將生成不同的激活鏈，包括各種細胞因子的釋放以及通道蛋白的激活[6-7]。而磷酸化細胞外調節蛋白激酶（pERK1/2）作為細胞內調節蛋白酶可能是NF-κB激活的信號傳遞者。因此，本研究旨在探究NF-κB信號通路激活在陰炎凈抗炎活性中的調節作用，并假設pERK1/2/NF-κB是關鍵的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究采用體重為50～60 g的SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，購自湖北省疾病預防控制中心，動物合格證號為42000600022106。每組動物分籠飼養，自由攝食。所有動物實驗均于中南民族大學實驗動物中心（SPF級）進行并嚴格根據中南民族大學動物實驗委員會制訂的實驗動物操作標準進行操作。

1.2 藥物與試劑

陰炎凈洗液（我院院內制劑，規格：250 mL，批號：20170503）；地塞米松磷酸鈉注射液（安微金太陽藥業，規格：5 mg/mL，批號：170712011）；DNCB（山東西亞化學股份有限公司，批號：W5656）；免疫組化試劑盒（三心達生物科技有限公司，貨號：1632）；Anti-NF-κB（p65）（貨號：GB11142）、Anti-pERK1/2（貨號：GB11510）、Anti-β-Actin（貨號：GB11001）、蛋白定量檢測試劑盒（貨號：G102）和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（貨號：G2003）均購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器設備

Leica RM2235型萊卡石蠟切片機（德國萊卡）；DP72奧林巴斯顯微成像系統（OLYMPUS）；D-37520高速離心機（Thermo Fisher Scientific，離心半徑60 mm）；CP114電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；凝膠成像系統（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 ACD動物模型制備

采用DNCB誘導大鼠ACD模型：將DNCB溶解在混合溶劑（丙酮/橄欖油，4∶1，V/V）中，配制成7%和1%的DNCB溶液。用硫化鈉徹底去除大鼠腹部2 cm2的毛發。第1天用7% DNCB溶液50 μL涂抹于除毛的腹部致敏，第2天用1% DNCB溶液50 μL增強致敏。第5天開始，每日將1% DNCB溶液20 μL涂抹于大鼠右耳，連續3 d，即制得DNCB誘發的ACD大鼠模型[8]，選取造模成功大鼠40只。

1.5 分組與給藥

取10只正常大鼠作為空白對照組；取40只ACD大鼠進行編號，然后按隨機數字表法將其分為ACD模型組、陽性對照組、高劑量治療組、低劑量治療組，每組10只?？瞻讓φ战M：純化水50 μL；ACD模型組：純化水50 μL；陽性對照組：地塞米松磷酸鈉注射液50 μL；高劑量治療組：2倍的陰炎凈液濃縮液（取約100 mL藥液，60℃減壓濃縮干至體積減半）50 μL；低劑量治療組：原倍陰炎凈50 μL。每天在右耳外側涂抹給藥2次，早晚8：00各1次，連續10 d。

1.6 皮膚變應性反應評估

經過藥物治療10 d，根據濕疹面積和嚴重程度評估右側耳組織變應性反應。通過6 mm打孔器取耳組織塊進行計重和耳厚度測量來評估耳腫脹度。同時各組取3只大鼠的樣本用4% PFA固定，石蠟包埋切片（4 μm），HE染色[9]，根據單核細胞浸潤、表皮角化程度進行評估。

1.7 免疫組織化學分析

檢測大鼠耳組織中的pERK1/2和總NF-κB（p65）的蛋白表達水平。取3只大鼠的右耳石蠟切片，應用經典石蠟切片的免疫組織化學方法[10]進行操作，即經過脫蠟、固定后，按試劑盒操作步驟加入一抗（1∶500稀釋）、二抗，然后染色并封片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各樣本的平均光密度（IOD）值，其中統計數據表現為各組樣本的平均IOD值與空白對照組的平均IOD值的比值。

1.8 蛋白免疫印跡實驗

檢測大鼠耳組織中的pERK1/2和總NF-κB（p65）的蛋白表達水平。每組取6只大鼠組織樣本，每次實驗采用2只大鼠的樣本進行混合，進行3次重復實驗。依據常規的免疫蛋白的實驗方法，首先將樣本用PBS清洗。在冰浴條件下完全裂解組織得到勻漿液，離心后取上清液。制得的蛋白樣本經12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉膜。免疫反應過程：經過封閉1 h后，一抗（1∶200稀釋）孵育過夜，洗脫后二抗孵育[11]。經分子凝膠成像系統成像后用Alpha軟件處理系統分析目標條帶的灰度值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以均值±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett′s t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠大鼠耳變應性反應比較

經過10 d的藥物處置，ACD模型組大鼠右耳仍呈現明顯的紅腫、結痂，而陽性對照組治療后基本恢復到正常耳朵的樣子，偶見一些耳靜脈充血，高劑量治療組的耳朵恢復與陽性對照組類似，低劑量治療組大鼠的耳朵可見輕微紅腫，見圖1（封三）。與空白對照組比較，ACD模型組大鼠耳厚度和耳重量明顯增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與ACD模型組比較，高劑量治療組和低劑量治療組的耳厚度和耳重量均明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠右耳組織病理學變化比較

與空白對照組比較，ACD模型組大鼠右耳出現明顯的單核細胞浸潤和表皮細胞角化，并且在切片中也可見ACD模型組大鼠耳朵有顯著的腫脹，并且這些單核細胞浸潤和表皮細胞角化現象在陽性對照組、低劑量治療組、高劑量治療組中都有顯著的改善。見圖2。

2.3 各組大鼠pERK1/2表達水平比較

免疫組化和蛋白免疫印跡的結果均顯示：與空白對照組比較，ACD模型組pERK1/2的蛋白表達水平顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與ACD模型組比較，高劑量治療組和低劑量治療組的pERK1/2蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3（封四）。

2.4 各組大鼠NF-κB（p65）表達水平比較

免疫組化和蛋白免疫印跡的結果均顯示：與空白對照組比較，ACD模型組NF-κB的蛋白表達水平顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與ACD模型組比較，高劑量治療組和低劑量治療組的NF-κB的蛋白表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖4（封四）。

3 討論

NF-κB是一種核轉錄因子，它調節大量基因的表達，這些基因對細胞凋亡、炎癥和各種自身免疫性疾病的調節至關重要。NF-κB的活化被認為是應激反應的一部分，因為它被多種刺激物激活，包括生長因子、細胞因子、淋巴因子和藥理學藥物[12-15]。而NF-κB系統的研究大多集中于NF-κB信號通路激活后對細胞分泌IL-1[16-19]和TNF-α[20-23]的影響，而藥物作用于機體后如何進一步激活NF-κB尚不明確，膜受體蛋白類如Toll蛋白家族被認為是參與活化的關鍵分子[24-26]。本研究中DNCB誘導的ACD大鼠體內同樣測得NF-κB蛋白表達量顯著增加。為了進一步探究ACD類型的炎性反應的信號通路，本研究著重通過檢測與NF-κB相關的信號蛋白分子pERK1/2的表達水平的變化來闡明炎癥信號的傳遞[27-30]。pERK1/2是細胞內信號傳遞的重要信使，結合本研究中免疫組化和蛋白免疫印跡結果分析，ERK在與半抗原DNCB細胞表面接觸后迅速磷酸化。這一過程可能加速了NF-κB系統的信號轉導，最終誘發了嚴重的炎性反應[31]。而本研究的治療藥物陰炎凈經過10 d的給藥期，使ACD大鼠體內的pERK1/2和NF-κB蛋白表達水平顯著降低。提示陰炎凈對pERK1/2/NF-κB信號通路有顯著的抑制作用，且這種抑制作用在ACD大鼠中表現為抗炎的藥理活性。

本研究結果提示，陰炎凈對DNCB誘導的ACD大鼠耳變應性反應有顯著的改善作用，并且經過10 d的治療周期后，陰炎凈可通過抑制ERK的磷酸化來抑制NF-κB信號通路。由此我們可進一步判斷陰炎凈在ACD大鼠中發揮抗炎活性的分子機制可能是依賴于對pERK1/2/NF-κB信號通路的抑制作用。

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（收稿日期：2018-07-17 本文編輯：羅喬荔）