艾灸對壓力性損傷大鼠創面修復的影響

于杰 孫忠人 李洪玲

[摘要] 目的 觀察艾灸對壓力性損傷大鼠創面修復的影響。 方法 采用自制模型裝置通過缺血-再灌注損傷方式建立2～3期壓力性損傷動物模型，將造模成功的70只SD雌性大鼠隨機分為模型組與艾灸組，每組各35只。每組根據干預時間的長短再分為5個亞組，即1 d、3 d、5 d、7 d、10 d亞組，7只/亞組。將空白組35只正常健康大鼠隨機分為上述5個亞組，7只/亞組，不予造模，僅對模擬造模部位處進行碘伏處理。模型組于造模后只對創面進行碘伏常規處理，艾灸組在造模成功后，先對創面予碘伏處理，繼予艾灸回旋灸操作，以壓力性損傷創面為中心，1 cm長度為半徑，1次/d，15 min/次。依次在上述5個時間點標本采集前測定壓力性損傷創面面積，通過蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察其創面組織的病理形態學變化。 結果 治療1 d后，各組組間的壓力性損傷創面愈合率差異無統計學意義（P > 0.05）。艾灸組在其余4個時間點創面愈合率均明顯高于模型組，分別對同一時間點進行兩組組間比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。與模型組比較，艾灸組創面肉芽組織分別在生長狀態與出現時間方面存在明顯優勢，其創面面積縮小程度較為明顯，收縮速度更快。HE染色發現，艾灸組大鼠創面組織中的炎細胞浸潤高峰及肉芽組織出現時限均較模型組提前，成纖維細胞增生程度與數量更明顯，且出現時限較早。艾灸組大鼠創面更早出現新生血管和表皮結構的恢復。 結論 艾灸能夠有效促進壓力性損傷創面的愈合。

[關鍵詞] 艾灸；壓力性損傷；修復；創面愈合率；病理形態學

[中圖分類號] R245.81 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（a）-0004-06

[Abstract] Objective To observe the effect of moxibustion on wound repair in rats with pressure injuries. Methods The models of rats with pressure ulcers which belonged to stage 2-3 were established by using self-made devices of pressure ulcers. The models of 70 SD female rats with skin ischemia reperfusion injury were randomly divided into model group and moxibustion group. There were 35 rats in each group. Each group was divided into 5 subgroups including 1 d， 3 d， 5 d， 7 d and 10 d according to the length of intervention time. Seven experimental rats were included in each subgroup. The blank group was given shaving disinfection， tied together with other groups of rats given only conventional iodophor intervention. The model group was only given conventional iodophor intervention. The moxibustion group was given iodophor intervention at first and direct moxibustion intervention to the local tissue of pressure ulcer with cyclotron operation， with moxibustion once a day and 15 minutes each time. The wound area was measured respectively after five time-points （1 d， 3 d， 5 d， 7 d and 10 d after intervention or treatment） before drawing. HE staining was used to observe the pathological changes of the pressure ulcer. Results There were no significant differences in the wound healing rates between the groups in the 1 d after intervention（P > 0.05）. Compared with the model group， the wound healing rates of moxibustion group were significantly higher at the four time-points including 3 d， 5 d， 7 d and 10 d after treatment. At the same time-points， there were significant differences between the two groups （P < 0.01）. Compared with the model group， the granulation tissues in the wounds of rats which belonged to moxibustion group with pressure ulcers had obvious advantages both in the time-points and the growth states. There were granulation tissues at the third day after treatment in the moxibustion group， while those of model group appeared about at the seventh day after iodophor intervention. Simultaneously， the wound contraction rates of pressure ulcers were faster in the moxibustion group which had more evident area reductions. Pathological changes of pressure ulcers were observed by HE staining that the peaks of the inflammatory infiltrations which existed in the moxibustion group had appeared in advance compared with the model group. Meanwhile， fibroblasts appeared earlier， having more numbers and obvious degrees of hyperplasia. The occurrence time of granulation tissues was earlier in the moxibustion group. Hence， neovascularization which belonged to moxibustion group formed earlier than that of model group. The epidermal structures of rats in the moxibustion group recovered in advance. Conclusion Moxibustion can promote the wound healing effectively in rats with pressure injuries.

[Key words] Moxibustion； Pressure injury； Repair； Wound healing rate； Pathological morphology

壓力性損傷是一種由于局部組織長期受壓，繼而發生持續缺血、缺氧以及營養不良，最終致使組織發生潰爛、壞死的外科疾患。本病的發病因素眾多，主要包括三大類，即內源性因素、外源性因素與加劇性因素，其中多因素相互作用導致發病居多[1]。剪切力、摩擦力與垂直壓力共同構成壓力性損傷的外源性因素，上述三大力學因素在致病過程中或單獨或合并導致本病的發生[2-3]。營養、感覺障礙、年齡、意識水平、活動性等共同構成了壓力性損傷的內源性因素[3]。本研究動物模型評價參照NPUAP公布的最新指南（2016版）[4]，其分期嚴格按照該指南的最新界定標準。本課題組多年來致力于艾灸促進壓力性損傷組織血管新生的相關研究[5-12]，且采用艾灸治療壓力性損傷取得較滿意的臨床療效。本研究通過KP-21C型求積儀測定壓力性損傷創面愈合率、肉眼及蘇木精-伊紅染色（HE染色）觀察創面組織病理形態學變化，旨在客觀評價艾灸對壓力性損傷大鼠創面修復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

對120只體重230～245 g的雌性健康SD大鼠[黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物合格證：SYXK（黑）2013-012]給予單籠喂養，使其自由飲水、進食并活動[6-9]。在濕度40%～50%RH、溫度（19.0±2.1）℃、明暗周期12 h的環境中進行適應性喂養14 d后選取85只給予造模處理，另35只作為空白組，對實驗動物的處置符合動物實驗倫理標準。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 求積儀（KP-21C型、日本PLACOM），電子天平（MP200A型、上海精密儀器廠），造模裝置（玻璃板、純凈水瓶、十字形托盤、不銹鋼絲網、膠水、膨脹螺絲、帆布條、鋼珠、尼龍扎帶），電動理發器（寧波真漢子電器有限公司），非接觸式電子溫度計（廣州市金鑫寶電子有限公司）。DM4000B顯微鏡、EG1169組織包埋機及RM2235型切片機（德國LEICA），HI1220烘片機（德國LEICA），包埋盒（世泰實驗耗材有限公司）。

1.2.2 試劑 敏感肌膚型脫毛膏（薇婷牌，利潔時家化中國有限公司），五年陳艾（有煙艾條，規格：18 mm×200 mm，南陽藥益寶艾草制品有限公司），醫用酒精（安捷高科消毒制品有限公司），醫用碘伏（山東利爾康消毒科技有限公司）、醫用棉簽（沈陽北華醫材有限公司），生理鹽水（青島華仁藥業股份有限公司）。水溶性伊紅（碧云天生物技術），蘇木精染液（碧云天生物技術），無水乙醇（上海富宇），二甲苯（上海富宇），石蠟、10%中性甲醛溶液、鹽酸（均為上海富宇），蒸餾水[屈臣氏集團（香港）有限公司]，定性濾紙1001-6508（美國GEwhatman），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 自制裝置

①取3塊玻璃板（規格：6.0 cm×5.0 cm×1.5 cm）制成倒置的“U”形裝置，于水平玻璃板中心打孔，孔徑大小=膨脹螺絲外管外徑。②處理固定膨脹螺絲外管，確保螺釘錐度側沖下方從鐵管中穿行。③固定水瓶底座與螺紋。④調節螺絲外管高度后固定鐵管與水平玻璃板，系牢帆布條[7-9]。

1.4 模型制備

分別用塑料制尼龍扎帶將大鼠4個部位固定（腹部、雙側腋下、雙側踝部、雙側腹股溝內側），充分暴露造模部位后備皮處理（備皮長寬分別20 mm），消毒待造模處及螺釘錐度側。將造模裝置固定于大鼠腿部近膝關節骨隆突處（即造模處），通過缺血-再灌注損傷循環周期模式制備壓力性損傷動物模型。1個循環=缺血期（120 min）+再灌注期（30 min），5個循環/d，持續3 d。30 min的再灌注期解壓松綁大鼠，任其活動、飲水及進食。造模3 d后，持續1 d的觀察期，用以評價模型制備成功與否，并剔除制備失敗的動物模型[7-9]。

1.5 動物模型的評價

動物模型的評價參照2～3期壓力性損傷（即2016年NPUAP公布的最新指南）[4]，并進行肉眼（創面顏色、形態及滲出物性質）及行為學（大鼠整體狀態、性情、步態及二便等）觀察[13]。

1.6 實驗分組及干預治療

遵循先造模后隨機的原則，將85只實驗大鼠進行壓力性損傷缺血-再灌注模型制備，造模過程中共9只大鼠死亡，6只大鼠造模失敗。將造模成功的70只雌性SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為模型組和艾灸組，每組各35只。每組根據干預時間的長短再分為5個亞組，即1 d、3 d、5 d、7 d、10 d亞組，7只/亞組，造模后至干預過程中共有10只大鼠脫落。將空白組35只正常健康大鼠隨機分為上述5個亞組，7只/亞組，其中共有5只大鼠于備皮時出現負損傷而給予剔除，因此上述所有亞組最終每亞組6只大鼠納入實驗。三組動物捆綁方式均相同，即對大鼠腹部、雙側腋下、雙側踝部、雙側腹股溝內側4個部位通過塑料制尼龍扎帶捆綁固定于不銹鋼絲網上。空白組不予造模，僅對模擬造模部位處進行碘伏處理。模型組于造模后只對創面進行碘伏常規處理，艾灸組在造模成功后，先對創面予碘伏處理，繼予艾灸回旋灸操作，以壓力性損傷創面為中心，1 cm長度為半徑，1次/d，15 min/次。將艾條燃燒端及非接觸式電子溫度儀探頭與壓力性損傷創面的距離控制在30 mm左右，將艾灸溫度控制在40～42℃，測量溫度每隔30 s測1次，全程施灸操作需注意對艾條燃燒過程中產生灰燼的及時處理，旨在達到艾灸療效最佳化與負損傷最小化。

1.7 測定壓力性損傷大鼠創面愈合率

對各組大鼠分別選取兩個測量點（即造模后和取材前）進行創面面積的測定。首先，采用制版硫酸轉印紙（消毒后）通過透繪法對壓力性損傷創面處勾畫輪廓圖，將其掃描至計算機，然后對其等比例放大10倍后打印，利用KP-21C型求積儀測定經放大10倍后的圖形面積，再將測定面積值除以10倍，得出大鼠壓力性損傷創面實際面積值，最后分別測量3次取均值作為實驗大鼠壓力性損傷創面面積值。壓力性損傷大鼠創面愈合率=[（造模成功后的測量面積-取材前的測量面積）/造模成功后的測量面積]×100%。

1.8 觀察艾灸對實驗大鼠壓力性損傷創面組織的病理形態學改變的影響

1.8.1 標本采集 分別將模型組和艾灸組大鼠于治療1 d、3 d、5 d、7 d、10 d后進行標本采集，空白組大鼠隨同以上兩組于上述5個時間點取材處理。標本采集前對所有大鼠體重測定，根據體重不同分別給予對應的水合氯醛進行腹腔注射麻醉，取材區域為以壓力性損傷創面正中心為圓點，5 mm為半徑的皮膚全層組織。取材過程中注意勿將組織打卷，展平固定在濾紙中，置于包埋盒中，貯存在盛有10%的中性甲醛溶液，24 h內做包埋處理，標本采集后的所有大鼠脫頸椎處死。

1.8.2 包埋及HE染色步驟 包埋：采集后的標本置入已標號的新包埋盒。60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ，依次進行酒精梯度脫水。酒精和二甲苯等量混合及二甲苯浸泡，透明處理。在二甲苯和石蠟等量混合、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ進行浸蠟處理，包埋成塊。HE染色：①切片≤4 μm。②常規二甲苯脫蠟處理切片，梯度酒精脫水處理：二甲苯Ⅰ 5 min → 二甲苯Ⅱ 10 min → 無水乙醇Ⅰ 2 min → 無水乙醇Ⅱ 2 min → 95%乙醇1 min → 80%乙醇1 min → 75%乙醇1 min。③蒸餾水沖洗1 min。④蘇木精染色5 min → 沖洗。⑤將1%鹽酸乙醇分化30 s。⑥蒸餾水過洗60 s。⑦伊紅液染色2 min → 沖洗30 s。⑧常規脫水、透明處理：95%乙醇Ⅰ浸泡1 min → 95%乙醇Ⅱ 1 min → 無水乙醇Ⅰ 3 min → 無水乙醇Ⅱ浸泡3 min → 二甲苯Ⅰ 3 min → 二甲苯Ⅱ浸泡3 min。⑨封片：中性樹膠封片。⑩光學顯微鏡下觀察大鼠壓力性損傷皮膚的病理形態學改變。

1.9 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較選取ANOVA，多重比較選取LSD檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察艾灸對壓力性損傷大鼠損傷修復中創面愈合率的影響

觀察各組大鼠在不同時間點壓力性損傷創面愈合率的比較發現，治療1 d后，模型組和艾灸組兩組創面愈合率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。與模型組比較，艾灸組在治療3 d、5 d、7 d、10 d后的創面愈合率明顯升高。分別對同一時間點進行兩組組間比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 實驗大鼠壓力性損傷創面局部的肉眼觀察改變

空白組大鼠為正常皮膚組織，皮膚完整，外觀呈肉粉色，未見水腫及滲出等損傷，見圖1A。造模前期，大鼠創面顏色變紅，壓之不褪色，皮膚較完整，符合1期壓力性損傷的模型標準；造模后期，大鼠病灶創面伴有結痂，質地或軟或硬，或偏創面中央，或于創面周圍，部分水皰破裂漿液得以吸收，部分水皰仍然存在，創面仍表現水腫，顏色紅紫，符合2～3期壓力性損傷的特點；造模結束第1天晚即造模觀察評價期，大鼠的創面水腫，顏色或紅紫或蒼白，血性或黃色滲出物，符合2～3期壓力性損傷特點，即造模成功標志。見圖1B～D。

模型組大鼠在上述5個時間點經過碘伏處理后，創面愈合進程較艾灸組明顯滯后，但整體趨勢向愈合發展。碘伏處理3 d后，創面呈結痂狀態，質硬，膿性滲出物減少，血性滲出物仍存在，水腫明顯。碘伏處理7 d后，創面輪廓縮小明顯，結痂質地較前更軟，部分逐漸脫落，創面呈現粉紅色，肉芽組織較豐富。見圖2A～B。

艾灸組治療3 d后，其創面滲出物（血性）明顯減少，創面顏色呈鮮紅色，邊緣結痂，呈現柔軟的肉芽組織，水腫明顯緩解。治療5 d后，壓力性損傷創面滲出物顯著減少，較干燥，肉芽組織較3 d明顯豐富，創面顏色呈粉紅色，結痂質軟，尤其在創面邊緣處的結痂部分已與皮膚分離，創面面積縮小顯著。治療10 d后，創面顏色呈現皮膚本色或略白色。見圖3A～C。

2.3 HE染色觀察大鼠壓力性損傷創面組織的病理形態學改變

空白組鏡下清晰可見較完整的表皮全層結構，真皮層可見豐富的膠原纖維，見圖4A。模型組碘伏處理1 d后，鏡下所示真皮層內大量出血，以及少量的中性粒細胞浸潤，纖維組織斷裂及壞死。碘伏處理3 d后，表皮層斷裂，真皮層出現大量中性粒細胞浸潤，伴有出血。碘伏處理5 d后，真皮層可見大量的中性粒細胞浸潤，少許血管壞死及纖維增生。碘伏處理7 d后，損傷部位可見少量的膠原細胞增生，大量的成纖維細胞增生及毛細血管芽。碘伏處理10 d后，鏡下可見少量的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤、大量的膠原細胞、成纖維細胞增生。見圖4B～D。

艾灸組治療1 d后，鏡下所示部分表皮細胞呈脫落狀態，真皮層可見大量中性粒細胞浸潤。治療3 d后，真皮層出現小血管壞死，大量的中性粒細胞浸潤，出現少許毛細血管芽。治療5 d后，表皮的角質層、顆粒層清晰可見，其真皮層可見少許中性粒細胞浸潤，以及大量成纖維細胞為主的增生，毛細血管芽較3 d后明顯增多。治療7 d后，表皮層恢復程度尚可，真皮層可見少許炎細胞的浸潤及大量的成纖維細胞增生。治療10 d后，表皮結構恢復較好，傷口縮小明顯，可見毛囊細胞的增生，真皮層少許的成纖維組織增生伴有大量的膠原纖維，肉芽組織較前減少。見圖5A～C。

3 討論

壓力性損傷與中醫學的“褥瘡”、“席瘡”或“壓瘡”病名對應。中醫學對席瘡的認識早在《外科啟玄》中便有記載，即“席瘡乃久病著床之人，挨擦磨破而成。上而背脊，下而尾閭，當用馬屁勃軟襯……病人但見席瘡，死之征也。”它不僅首次提出“席瘡”的概念，并在病因病機、發病部位及干預措施等方面加以概括。《靈樞·官能》：“針所不為，灸之所宜。”《醫學入門·針灸》載：“藥之不及，針之不到，必須灸之。”回旋灸屬于懸起灸的范疇，對于壓力性損傷、皮膚淺表性潰瘍以及其他慢性組織損傷等疾病的應用確有優勢。有煙艾灸在燃燒過程所發出熱、光、煙[14-15]，其中光譜輻射可能是促進發揮作用的關鍵因素，主要成分為近紅外輻射[16-17]，它能夠滲透至機體較深部位而發揮效應。另外，本課題將艾灸干預的溫度控制在40～42℃[18-22]的適宜范圍，旨在發揮艾灸治療壓力性損傷的最佳療效的同時避免出現負損傷。本研究采用透繪法結合求積儀測定各組大鼠在不同時間點壓力性損傷創面愈合率發現，3 d作為艾灸干預發揮促進創面愈合作用的起效時間，推測此療效的發揮可能需要建立在累積一定刺激量的基礎之上。因此，艾灸干預能夠促進壓力性損傷創面的愈合及修復，其療效是確切的。壓力性損傷大鼠創面局部的肉眼觀察改變也與上述結論基本相符。

壓力性損傷歸屬慢性及難愈性創面，由于在組織修復進程中的每一個階段均較一般皮膚損傷相對滯后，因此，其具有相對復雜的修復過程，而肉芽組織的形成處于關鍵的核心地位。肉眼觀察壓力性損傷創面愈合過程發現，艾灸組大鼠壓力性損傷創面肉芽組織在治療3 d后出現，而模型組在碘伏處理7 d后出現，即在肉芽組織出現的時限上艾灸組發揮優勢。在其生長狀態上，兩者比較亦是如此。艾灸組大鼠壓力性損傷創面面積縮小較模型組更加顯著，由此說明，艾灸干預促進壓力性損傷創面的修復，療效確切。HE染色結果發現，艾灸組大鼠創面組織中的炎細胞浸潤高峰及肉芽組織出現時間均較模型組提前，成纖維細胞增生程度與數量更明顯，且出現時限較早。艾灸組大鼠創面更早出現新生血管和表皮結構的恢復。由此說明，艾灸干預能夠從皮膚愈合的三個關鍵時期（即炎癥期、增生期和重塑期）分別促進創面的修復及愈合進程。即艾灸能夠促進壓力性損傷大鼠創面的愈合及修復，從整體上加速創面愈合的進程，從而縮短創面愈合的所需時間。本課題組在后續的研究中將分別通過透射電鏡觀察壓力性損傷創面組織的超微結構、從基因及蛋白層面探討艾灸促進壓力性損傷組織創面修復的可能機制。

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（收稿日期：2017-11-30 本文編輯：任 念）