結節性紅斑患者外周血單核細胞Toll樣受體9和NF—κB的表達和意義

楊憲魯　王海燕　湯華曉　叢濤　李玲芳

[摘要] 目的 研究結節性紅斑患者與健康對照人群外周血單核細胞中Toll樣受體9（TLR9）和核因子-κB（NF-κB）的表達情況，并分析其在結節性紅斑中的臨床意義。 方法 選擇2014年6月～2017年10月山東省威海市婦幼保健院及山東省威海市立醫院確診的結節性紅斑患者52例作為疾病組；另選健康體檢者41名作為對照組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測外周血單核細胞中TLR9和NF-κB的mRNA水平。 結果 疾病組外周血中TLR9 mRNA水平較對照組明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01），疾病組NF-κB mRNA水平較對照組明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。疾病組中TLR9與NF-κB的mRNA水平存在線性正相關關系（r = 0.89，P < 0.01）。 結論 與正常人群相比，結節性紅斑患者TLR9 mRNA水平明顯降低，NF-κB mRNA水平明顯升高，提示TLR9和NF-κB可能參與了結節性紅斑疾病的發病過程。

[關鍵詞] 結節性紅斑；外周血；Toll樣受體9；核因子-κB

[中圖分類號] R275.986.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0106-03

[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 9 （TLR9） and nuclear factor-κB （NF-κB） in peripheral blood mononuclear cell of erythema nodosum patients and healthy controls and to explore the clinical significance of TLR9 and NF-κB in erythema nodosum. Methods From June 2014 to October 2017， 52 patients with erythema nodosum from Weihai Women and Children′s Hospital and Weihai Municipal Hospital of Shandong Province were enrolled as disease group， and 41 healthy physical examinees served as control group. The mRNA levels of TLR9 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cell were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technique. Results The level of TLR9 in disease group was lower than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The level of NF-κB in disease group was higher than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. In disease group， there was a positive linear correlation between TLR9 mRNA and NF-κB mRNA （r = 0.89， P < 0.01）. Conclusion Compared with normal people， the level of TLR9 mRNA in erythema nodosum patients is significantly decreased， while the level of NF-κB mRNA is significantly increased， suggesting that TLR9 and NF-κB may play an important role in the occurrence and development of erythema nodosum.

[Key words] Erythema nodosum； Peripheral blood； Toll-like receptor 9； Nuclear factor-κB

結節性紅斑（erythema nodosum，EN）是臨床常見的一種病因復雜并易反復發作的炎癥性皮膚病，病理表現為間隔性脂膜炎，主要臨床表現為雙小腿伸側疼痛性、對稱性紅色結節，結節為非潰瘍性，可自行消退，青年女性好發[1]。EN確切的發病機制目前尚不明確，其發生可能是機體對某些病原微生物抗原的一種遲發型超敏反應，也可能是一種免疫復合物疾病[2]。人類Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是近年來發現的一類新的細胞表面信號傳導跨膜受體，是人體固有免疫和適應性免疫的橋梁，是一種機體通過感知微生物病原體直接作出防御反應的天然免疫受體，TLR9是TLR家族的重要成員，能識別多種微生物的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），通過刺激信號的級聯反應誘導炎癥介質和炎性細胞因子的產生，從而參與多種感染性疾病的進展[3]。核因子-κB（NF-κB）是一種重要的轉錄調控因子，在免疫應答中發揮重要作用，主要是通過與啟動子及增強子的作用，從而促進多種免疫細胞及細胞因子的活化。TLR9和NF-κB是否參與了EN的發生發展，國內外鮮見相關報道。本研究通過檢測EN患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中TLR9和NF-κB的表達，探討TLR9和NF-κB在EN發病機制中的可能作用，為深入開展EN免疫相關研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月～2017年10月山東省威海市婦幼保健院、山東省威海市立醫院皮膚科門診及住院患者52例為疾病組，其中男13例，女39例；年齡19～51歲，平均（29.4±5.8）歲；病程1 d～10年，平均（1.3±0.6）個月；輕型13例，中型34例，重型5例。另收集上述兩所醫院的健康體檢者41名為對照組，其中男17名，女24名，年齡20～52歲，平均（30.4±5.2）歲。兩組年齡、性別差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

納入標準：所有患者均具有典型臨床表現，皮膚組織病理學檢查符合EN，診斷及分型符合文獻診斷分型標準[4]。排除標準：①1個月內系統應用糖皮質激素、免疫調節劑或抗組胺藥物；②肝腎功能異常；③糖尿病、系統性紅斑狼瘡、心血管病、嚴重肝腎功能損傷性等系統疾病；④麻風EN；⑤妊娠及哺乳期婦女。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書，本研究獲醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分離PBMC 收集患者及健康體檢者靜脈血2～3 mL，肝素抗凝管保存，淋巴細胞分離液密度梯度離心法（2000 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min）分離PBMC，放置-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 測定PBMC中TLR9及NF-κB水平 將PBMC復融并平衡至室溫，加入1.5 mL RNAiso Plus（總RNA提取試劑，大連寶生生物公司，批號：16105）提取總RNA。用Real-time PCR（杭州博日科技有限公司，擴增儀型號：LineGene 9600 series）檢測TLR9及NF-κB mRNA表達量。按試劑盒（美國Thermo公司，DRR037A，批準文號：0020150918）說明，參照Genbank中目的基因mRNA序列設計相關引物（引物由上海生工生物工程有限公司合成），見表1，反應條件為45℃預變性60 min，70℃變性5 s，4℃退火5 h，共運行45個循環。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以例表示，采用χ2檢驗，相關性分析應用Pearson分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血TLR9和NF-κB的mRNA水平比較

疾病組TLR9 mRNA水平明顯低于對照組，NF-κB mRNA水平明顯高于對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.2 兩組中TLR9與NF-κB相關性分析

疾病組中TLR9與NF-κB存在線性正相關關系（r = 0.89，P < 0.01）。

3 討論

EN是一種以雙下肢疼痛性紅斑為主要臨床特征的炎癥性皮膚病[5]，其病因復雜，主要包括感染、特發性、藥物、自身免疫性疾病、腫瘤、妊娠等[6]。目前主要診斷依據是臨床表現和組織病理學診斷，其中組織病理學的主要表現為間隔性脂膜炎。EN發病機制多樣，可為一種獨立的皮膚病，也可為其他疾病的皮膚表現，臨床上需要根據臨床表現、病史和實驗室檢查進行綜合診斷[7]。張琛等[8]認為病原微生物感染人體誘導疾病發生，從而引起機體免疫功能紊亂是發病的主要原因，其中免疫機制在EN發生和發展中起重要作用。譚自明等[9]對27例EN患兒的病因及免疫特點進行分析，發現細胞免疫紊亂可能在EN發病過程中起到重要作用。陳麗莉等[10]通過研究EN患者皮損處CD4、CD8表達情況，發現疾病組CD4陽性表達率明顯高于正常組，CD8陽性表達率與正常組相比無統計學差異，說明CD4+T細胞在EN皮損的發病過程中起重要作用，從而提示EN患者皮損處存在著T淋巴細胞亞群的失衡。

研究表明，TLRs在機體感染防御中起重要作用，是機體抵抗感染的第一道屏障[11-12]。TLRs能夠識別自身RNA和DNA而引起自身免疫性疾病[13]，如血管炎中可通過活化和調節獲得性免疫應答促進疾病的發生發展[14]。韓晨珠等[15]發現結節性紅斑患者皮損處人類白細胞DR抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）分子高表達，間接證實T淋巴細胞介導的細胞免疫反應在EN的發生、發展中起重要作用。作為TLR家族成員之一，TLR9表達于免疫細胞，在PBMC中，主要表達TLR9的細胞是漿細胞來源的樹突狀細胞和B細胞[16]，通過與細菌DNA作用而誘導機體的固有免疫反應。研究表明TLR9參與感染過程，主要是通過識別細菌或病毒上未甲基化的CpG序列完成[17]。TLR9活化的信號傳導屬于典型的Toll樣受體信號通路，可以啟動經典的NF-κB途徑，產生大量炎性細胞因子，幫助機體抵御感染等致病因素[18]。TLR9能夠直接參與抵抗病原微生物的侵襲，同時也可以通過釋放特異的炎癥介質和啟動相應免疫細胞，從而在免疫應答中發揮重要作用[19]。也有研究發現，激活TLR9可誘導人B淋巴細胞表面活化因子（B-cell activating factor，BAFF）的表達，進一步促進BAFF的增殖，從而推測激活人B淋巴細胞表面的TLR9在自身免疫性疾病發病機制中發揮了重要的作用[20]。

目前對于TLR在EN患者中的表達及相關性報道很少，由于TLR9、NF-κB在感染和疾病免疫中的重要作用，深入研究TLR9、NF-κB在EN患者外周血中的表達，有助于EN發病機制的進一步明確。本研究通過對EN患者與健康人群進行對比研究，發現疾病組TLR9 mRNA水平較對照組明顯降低（P < 0.01），疾病組NF-κB mRNA水平較對照組明顯升高（P < 0.01），提示EN疾病的發生可能與TLR介導的相關信號傳導產生炎性因子有關，其可能的機制為當TLR9被細菌或病毒等配體激活后，經多步反應，導致NF-κB等轉錄因子轉核，共同參與固有免疫應答，對了解EN患者PBMC中TLR9和NF-κB的表達率和定量表達水平的差異有重要意義，同時能進一步證實本病的發生與感染的密切關系。本研究還發現疾病組PBMC中TLR9和NF-κB的mRNA水平具有線性正相關關系，因此我們推測在EN發病過程中，內源性或外源性因素使得機體免疫上游的TLR9、NF-κB被激活，引起炎癥介質，包括細胞因子、自由基等的釋放，引起補體級聯反應，打破機體的免疫耐受，導致EN的發病。

綜上所述，TLRs在EN患者發病過程中具有極其重要的作用，TLR9、NF-κB可能是EN發病的重要免疫調控因素之一，也可能對EN患者感染的發生和控制有著重要的介導作用，嚴密監測EN患者外周血中TLR9及NF-κB的mRNA水平變化，對本病的診療具有重要的診斷價值，從而為EN患者疾病的預防與感染的控制開辟新的思路。本研究樣本量較少，可能造成實驗結果的局限性，后續仍需進行大樣本量的實驗進一步證實。

[參考文獻]

[1] Passarini B，Infusino SD. Erythema nodosum [J]. G Ital Dermatol Venereol，2013，148（4）：413-417.

[2] Crameri R. Immunoglobulin E-binding autoantigens：biochemical characterization and clinical relevance [J]. Clin Exp Allergy，2012，42（3）：343-351.

[3] 王曉莉，何振娟.Toll樣受體9與感染性疾病[J].安徽醫學，2014，35（12）：1771-1774.

[4] 趙辨.中國臨床皮膚病學[M].南京：江蘇科學技術出版社，2009：1140-1141.

[5] 張琛，高炳愛，陳玉欣，等.結節性紅斑的診療進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2016，32（12）：746-748.

[6] 劉白，姜祎群.結節性紅斑的病因學研究進展[J].國際皮膚性病學雜志，2016，42（1）：30-32.

[7] 王麗瑋，徐浩翔，崔盤根.結節性紅斑的診療進展[J].中華皮膚科雜志，2017，50（3）：225-228.

[8] 張琛，高炳愛，陳玉欣，等.結節性紅斑的病因及發病機制[J].中國麻風皮膚病雜志，2015，31（7）：408-410.

[9] 譚自明，余亮，李奇鳳，等.兒童結節性紅斑的病因及免疫特點分析[J].臨床兒科雜志，2018，36（4）：316-317.

[10] 陳麗莉，韓晨珠，王艷心，等.結節性紅斑患者皮損處CD4、CD8表達的變化及意義[J].承德醫學院學報，2018， 35（2）：93-96.

[11] Takeda K，Kaisho T，Akira S. Toll-like receptors [J]. Annu Rev Immunol，2003，21：335-376.

[12] Moon SJ，Park MK，Oh HJ，et al. Engagement of toll-like receptor 3 induces vascular endothelial growth factor and interleukin-8 in human rheumatoid synovial fibroblasts [J]. Korean J Intern Med，2010，25（4）：429-435.

[13] Hurst J，von Landenberg P. Toll-like receptors and autoimmunity [J]. Autoimmun Rev，2008，7（3）：204-208.

[14] Jimenez-Dalmaroni MJ，Gerswhin ME，Adamopoulos IE. The critical role of toll-like receptors--From microbial recognition to autoimmunity：A comprehensive review [J]. Autoimmun Rev，2016，15（1）：1-8.

[15] 韓晨珠，陳麗莉，杜鎮，等.結節性紅斑患者皮損處HLA-DR分子的表達及意義[J].廣東醫學，2016，37（9）：1353-1355.

[16] 李寧，范學工.TLR9免疫識別CpG DNA的機制與途徑[J].醫學分子生物學雜志，2003，25（5）：291-294.

[17] 邱平，李曉嵐.Toll樣受體9在系統性紅斑狼瘡中的作用研究進展[J].中國皮膚性病學雜志，2012，26（10）：945-947.

[18] 鮑文朵娜，施少林.Toll樣受體9的功能及其致病機制[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2016，25（5）：456-460.

[19] 陳海蓮，楊曉娥.系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞Toll樣受體9和核因子-κB水平的測定及其臨床意義[J].中國現代醫學雜志，2016，26（11）：63-67.

[20] Abu-Rish EY，Amrani Y，Browning MJ. Toll-like receptor 9 activation induces expression of membrane-bound B-cell activating factor（BAFF）on human B cells and leads to increased proliferation in response to both soluble and membrane-bound BAFF [J]. Rheumatology（Oxford），2013，52（7）：1190-1201.

（收稿日期：2018-04-02 本文編輯：張瑜杰）