電針對慢性疲勞綜合征大鼠行為學(xué)及大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響

楊燕　王德龍　郭靜　石天宇　屈媛媛　王月　孫維伯　楊添淞

[摘要] 目的 觀察頭部電針對復(fù)合因素刺激所致慢性疲勞綜合征大鼠的行為學(xué)改變和海馬、下丘腦組織形態(tài)學(xué)改變的影響。 方法 選取SD大鼠36只，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和針刺組，每組各12只。模型組和針刺組采用復(fù)合因素刺激的方法建立慢性疲勞綜合征模型，針刺組電針百會、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)，觀察大鼠在曠場中的活動情況和大鼠海馬、下丘腦組織形態(tài)變化情況。 結(jié)果 治療前，與正常組比較，模型組和針刺組大鼠的水平活動和垂直活動明顯減少（P < 0.01）；治療后，與模型組比較，針刺組大鼠的水平活動和垂直活動明顯增多（P < 0.01）。HE染色顯示，治療前，與正常組比較，模型組和針刺組大鼠海馬、下丘腦神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)上和數(shù)量上的病理改變，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，毛細(xì)血管水腫；治療后，與模型組比較，針刺組大鼠海馬、下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的病理改變有所改善。 結(jié)論 頭部電針可以明顯改善慢性疲勞綜合征模型大鼠的中樞性疲勞狀態(tài)，該作用機制可能與電針對海馬、下丘腦神經(jīng)元的修復(fù)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 電針；慢性疲勞綜合征；曠場實驗；下丘腦；海馬

[中圖分類號] R255.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0009-04

[Abstract] Objective To observe the effect of head electroacupuncture on behavioral changes and morphological changes of hippocampus and hypothalamus in rats with chronic fatigue syndrome induced by composite factors stimulation. Methods Thirty-six SD rats were selected and divided into the normal group， the model group and the acupuncture group by random number table， with 12 rats in each group. The model group and the acupuncture group used the composite factors stimulation to establish the chronic fatigue syndrome model. The acupuncture group was treated with electroacupuncture of baihui， ningshen and bilateral sensory areas to observe the activity of rats in the open field and the changes of tissue morphology in hippocampus and hypothalamus of the rats. Results Before treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the model group and the acupuncture group were significantly reduced compared with the normal group （P < 0.01）. After treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the acupuncture group were significantly increased （P < 0.01）. HE staining showed that the hippocampus and hypothalamus neurons in the model group and the acupuncture group showed morphological and quantitative pathological changes before treatment. The number of apoptotic cells and capillary edema was increased in the model group and the acupuncture group. The pathological changes in the hippocampus and the hypothalamus of the rats in the acupuncture group were improved after treatment. Conclusion Head electroacupuncture can obviously improve the central fatigue state of model rats with chronic fatigue syndrome， which may be related to the repair of neurons in the hippocampus and hypothalamus by electroacupuncture.

[Key words] Electroacupuncture； Chronic fatigue syndrome； Open field test； Hypothalamus； Hippocampus

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種復(fù)雜的難治性疾病，以慢性虛弱性疲勞為特征，常在用力后加重，經(jīng)充分休息不能緩解、病程進(jìn)展緩慢，遷延不愈，其常見伴隨癥狀有肌肉酸痛、咽喉腫痛、關(guān)節(jié)活動不利等軀體感覺不適，以及抑郁、焦慮、睡眠障礙等精神異常[1]。目前關(guān)于本病的病因病機、診斷和治療均不明確，其發(fā)病機制可能與神經(jīng)、免疫、精神等因素相關(guān)[2-4]。中醫(yī)認(rèn)為本病與五臟功能虛損、氣血陰陽不足有關(guān)，臨床上針刺對于本病的治療具有顯著療效[5]。本研究通過觀察電針大鼠百會、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)對大鼠行為學(xué)及下丘腦、海馬形態(tài)的影響，進(jìn)一步闡明電針治療CFS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性清潔SD大鼠36只，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK黑2008-004。

1.1.2 儀器 6805-Ⅱ電針儀（常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司）；攝像機（HDR-PJ200，日本索尼公司）；曠場箱（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心自制）；2135型切片機（德國菜卡）；moticam3000顯微攝影系統(tǒng)（美國motic）；電熱恒溫箱（上海一恒）；大鼠聲光電刺激實驗裝置（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心自制）；TES-1350A型噪音機（臺灣泰仕）。

1.2 方法

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和針刺組，每組各12只。根據(jù)CFS多因素致病的特征，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]采用復(fù)合因素刺激的方式對模型組和針刺組進(jìn)行造模，正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。造模成功標(biāo)準(zhǔn)參考高懷林等[9]疲勞評分量表，即動物出現(xiàn)精神倦怠，嗜臥，皮毛稀疏失去光澤，眼神黯淡無光，身體逐漸消瘦，自主活動明顯減少，瞇眼明顯，糞便稀，反應(yīng)力明顯降低，則說明造模成功。

1.2.1 負(fù)重力竭游泳 正式造模前，先將大鼠置于深35 cm的水池中[水溫（25±2）℃]適應(yīng)性游泳3 d，每日1次，每次游泳20 min。適應(yīng)后，將大鼠負(fù)重自身體重5%的重物，游泳至力竭，每日1次，連續(xù)游泳28 d。

1.2.2 慢性應(yīng)激刺激 大鼠力竭游泳后給予包括禁水12 h、禁食12 h、通宵照明、夾尾（1 min）、噪聲刺激（110 dB，1 h）的不可預(yù)知的應(yīng)激刺激，以上刺激每天隨機給予2種，以避免適應(yīng)發(fā)生。

1.3 電針干預(yù)

造模成功后，對針刺組進(jìn)行電針治療。選穴：百會、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)，參照《實驗針灸學(xué)》[10]動物標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜取穴。針具：0.35 mm×25 mm安迪牌針灸針。治療方法：于大鼠針刺部位常規(guī)剪毛消毒，用毫針在百會、寧神、感覺區(qū)（雙）處快速刺入皮下15 mm，接6805-Ⅱ電針儀調(diào)至連續(xù)波，電針治療每日1次，每次30 min，連續(xù)治療15 d，正常組和模型組不給予任何治療，模型組每天給予針刺組相同時間捆綁，排除由針刺時捆綁造成的誤差。

1.4 一般情況觀察

造模和治療期間，每天觀察并記錄大鼠的飲水量、進(jìn)食量、體重、大鼠糞便及皮毛色澤、休息時身體的姿勢變化等情況。

1.5 行為學(xué)觀察

治療前和治療后分別進(jìn)行曠場實驗評估，具體操作為：將大鼠依次放入高60 cm、底面100 cm×100 cm的曠場箱中，曠場箱的底面平分為25個小方格，記錄大鼠在3 min內(nèi)的活動情況，包括水平運動得分（即3 min內(nèi)穿越格子數(shù)）和垂直運動得分（即后肢站立次數(shù)）。

1.6 病理形態(tài)學(xué)觀察

1.6.1 取材 實驗結(jié)束后，實驗動物經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，用4℃生理鹽水經(jīng)心灌注，當(dāng)循環(huán)液體顏色變清時，換用冷的4%多聚甲醛PBS液繼續(xù)灌注固定，直至大鼠四肢肌肉發(fā)硬僵直，肝、肺逐漸變白停止心臟灌注，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中備用。

1.6.2 腦組織切片制備 冰盤上將固定好的大鼠腦組織分別取海馬和下丘腦，流水沖洗后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm，展片撈起，置于60℃烘箱中12 h，取片進(jìn)行HE染色，并于鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

28 d后，模型組、針刺組大鼠出現(xiàn)體重下降、食量下降、皮毛脫落、瞇眼懶動、大便不成形等表現(xiàn)，提示造模成功，通過15 d的治療，與模型組比較，針刺組大鼠飲水、進(jìn)食量基本恢復(fù)正常，精神尚可，皮毛顏色較有光澤，體重有緩慢增長，自主活動增加，糞便均正常。

2.2 曠場實驗結(jié)果

治療前，模型組和針刺組大鼠水平活動和垂直活動的次數(shù)均明顯少于正常組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。治療15 d后，針刺組的水平活動和垂直活動的次數(shù)均明顯多于模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。治療后，針刺組水平活動和垂直活動次數(shù)均明顯多于治療前（P < 0.05），而正常組、模型組與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 HE染色結(jié)果

光鏡下觀察，模型組大鼠海馬、下丘腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)欠規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色欠清晰；膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目稍增多，凋亡小體數(shù)目增多；神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)疏松，炎癥細(xì)胞數(shù)目明顯增多。與模型組比較，針刺組大鼠海馬、下丘腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)整，胞質(zhì)胞核較清晰，凋亡小體和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有所減少，毛細(xì)血管水腫程度和炎癥細(xì)胞數(shù)量有所減輕。見圖1。

3 討論

目前，對CFS的發(fā)病機制研究尚未闡釋清楚，但有研究表明，CFS常由多重因素共同致病[1]。介于發(fā)病機制的復(fù)雜性和臨床表現(xiàn)的多樣性，目前對于本病研究的動物模型制備并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，制備的模型也無法完全模擬CFS的全部癥狀，本研究選用多因素復(fù)合刺激的造模方式，最大限度地模擬了CFS的多重應(yīng)激機制。

在治療方法上，本研究采用頭針結(jié)合電刺激，可加強針刺作用，更有效地改善大腦功能[11-12]。頭為諸陽之會，針刺頭部腧穴能激發(fā)人體陽氣，使氣血運行通暢，臟腑功能得復(fù)。其中百會又稱“三陽五會”匯集手足三陽脈和五臟之精，具有保健強壯、醒神開竅的作用。寧神，位于督脈神庭與印堂中點[13]，解剖位置位于大腦前額葉在體表的投影區(qū)，具有寧心安神、調(diào)節(jié)情志的作用，感覺區(qū)位于運動區(qū)（運動區(qū)上點位于前后正中線中點后0.5 cm；下點為眉枕線和鬢角發(fā)際前緣相交處）向后1.5 cm的平行線，解剖位置為中央后回在體表的投影，可緩解肢體疼痛及感覺異常。頭部電針治療復(fù)合因素誘導(dǎo)的CFS大鼠，既能疏通經(jīng)脈，激發(fā)陽氣，醒腦開竅，又能調(diào)節(jié)針刺相對應(yīng)的額頂葉大腦功能。

本研究過觀察動物造模過程中的狀態(tài)變化和在曠場實驗中的運動情況來反映造模情況和針刺療效。通常大鼠在曠場中的水平運動得分反映了大鼠的運動能力，而垂直運動得分則反映大鼠對外界環(huán)境的好奇心和探索能力[14]。本研究中，治療前，模型組和針刺組與正常組比較，垂直運動和水平運動次數(shù)明顯減少（P < 0.01），提示大鼠自主活動能力下降。治療后，模型組大鼠垂直、水平活動次數(shù)與治療前無明顯差異，而針刺組大鼠垂直、水平運動次數(shù)明顯多于治療前及模型組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），這提示模型組大鼠自主活動能力沒有明顯改善，而針刺治療對CFS大鼠疲勞狀態(tài)有明顯改善作用。

在CFS的機制研究方面，神經(jīng)內(nèi)分泌與CFS的關(guān)系已經(jīng)成為了近年來的研究熱點[15]，研究中，大部分集中在下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的調(diào)節(jié)機制上，CFS患者多存在HPA功能低下[16-17]，表現(xiàn)為HPA軸對應(yīng)激因素的低敏感性、對糖皮質(zhì)激素的高敏感性和HPA軸激素的低水平分泌，而下丘腦作為HPA軸功能啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其功能狀態(tài)與CFS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。根據(jù)CFS患者表現(xiàn)出的健忘、注意力不集中等精神障礙，可推測海馬作為學(xué)習(xí)記憶的中樞調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，其病理形態(tài)學(xué)改變可能與CFS 的發(fā)生有關(guān)。本研究對大鼠海馬、下丘腦進(jìn)行HE染色，探究頭部電針對海馬、下丘腦病理形態(tài)學(xué)變化的影響，經(jīng)過15 d的治療，與模型組比較，針刺組大鼠海馬及下丘腦HE染色顯示神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，毛細(xì)血管水腫減輕，提示頭部電針可以減少CFS大鼠海馬和下丘腦區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞病理變化，從而起到緩解疲勞癥狀、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用。本研究提示針刺可以通過改善CFS大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)而起作用，其分子機制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2018-04-25 本文編輯：張瑜杰）