sikFBA4基因啟動子的克隆及低溫表達模式分析

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(農業生物技術重點實驗室，石河子大學生命科學學院，新疆 石河子832000)

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-diphosphate, FBAase)存在于卡爾文循環(Calvin cycle)、糖異生(gluconeogenesis)、糖酵解(glycolysis)以及磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)等生物體維持正常生命活動所需的代謝途徑中，并在碳、氮代謝及糖代謝等過程中起著極為重要的作用[1]。光合數學建模的研究指出，果糖-1,6-二磷酸醛縮酶能夠調控光合碳代謝的速率[2]。然而到目前為止，對于光合碳流量控制的研究還沒有涉及溫度的因素，實際上溫度對光合酶活性的影響是最直接的。Brüggemann等[3]和Pérez-Torres等[4]的研究表明，來源于不同生境、不同遺傳背景植物的酶，其動力學特性不同，來源于抗寒植物的酶具有更好的低溫適應性。

新疆天山雪蓮(Saussureainvolucrata)屬菊科風毛菊屬，生長在海拔2400～4100 m的雪線附近的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，晝夜溫差較大，最高月平均溫3～5 ℃，最低月平均溫-21～-19 ℃[5]，生長環境極其惡劣。而雪蓮能在這種極端的環境下快速生長，表明雪蓮具有極強的耐寒、抗輻射、抗缺氧的能力[6-7]。

啟動子是位于結構基因5′端上游的一段DNA序列，能夠與RNA聚合酶特異性地結合并起始功能基因的轉錄。啟動子是基因表達調控的一個重要的組成部分，能夠決定基因轉錄的起始、效率和時空特異性。在轉基因植物研究中，組成型啟動子已經被廣泛地應用，但由于組成型啟動子恒定而持續表達的特點，造成物質和能量的過度消耗和不必要的浪費，使轉基因植物常表現出植株矮小，產量和品質下降等問題。誘導型啟動子能夠在不同的生境條件下對基因的表達進行精準的調控，從而避免基因過量表達而造成的生物體的失衡。因此，研究誘導型啟動子在植物轉基因中的應用具有重要的實踐意義。

在實驗過程中發現，定位于葉綠體的sikFBA4能夠對低溫脅迫做出敏感的響應。因此推測PsikFBA4可能具有在寒冷條件下誘導基因表達的功能。為進一步研究sikFBA4在天山雪蓮中的低溫調控機制，以天山雪蓮為材料，采用Hi-Tail PCR[8]的方法分離sikFBA4的啟動子序列，并驗證其在冷誘導方面的功能，為冷脅迫下光合碳流量控制的研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

天山雪蓮由石河子大學農業生物技術重點實驗室組培繁殖；本氏煙(Nicotianabenthamiana)由石河子大學農業生物技術重點實驗室組培繁殖。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR反應與sikFBA4的表達量分析 利用本實驗室天山雪蓮組培苗，于2017年11月對蓮葉座伸展至5葉期的天山雪蓮幼苗進行低溫處理，并以正常條件下(19 ℃)的雪蓮組培幼苗作為對照，處理時間分別為1、3、6、12和24 h，每個處理進行3次重復。所有材料在處理后用液氮進行速凍并保存于-80 ℃冰箱備用。

根據已獲得的sikFBA4基因的cDNA序列設計實時熒光定量引物(表1)，以天山雪蓮的持家基因GAPDH作為內參，引物序列參照郭新勇等[9]的研究。分別提取經過不同處理的雪蓮組培苗RNA并反轉錄成cDNA備用。按照SYBR GreenⅠMaster Mix說明書進行qRT-PCR，采用相對定量2-ΔΔCt法計算sikFBA4在不同低溫脅迫下的表達。

1.2.2sikFBA4基因啟動子的克隆 以天山雪蓮組培苗為材料，按照新型植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取天山雪蓮的基因組總DNA。

根據本實驗室已克隆到的雪蓮sikFBA4的基因序列設計3條嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，同時合成4條隨機簡并引物LAD1～LAD4和一條較短的特異性引物AC1(表1)。

表1 實驗所需引物Table 1 Primers used in this experiment

以雪蓮基因組DNA為模板，利用Hi-Tail PCR擴增FBA4的上游序列。第1輪PCR反應體系為：DNA模板1 μL、隨機簡并引物LAD1～4各0.5 μL，引物SP1 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×Easy Taq PCR SuperMIX 10 μL。在第2輪反應中，將第1輪PCR產物稀釋50倍作為第2輪反應的模板，SP1替換為SP2，其余條件不變；在第3輪反應中，將第2輪反應產物稀釋50倍作為模板，SP2替換為SP3，其余條件不變。PCR反應程序參考Liu等[8]的方法。

PCR反應結束后，利用1%的瓊脂糖凝膠分別對第2輪和第3輪 Hi-Tail PCR 擴增結果進行檢測，選取第3輪結果中符合大小差異的特異性條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。再將回收產物連接pEasy-T5 載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆后，將鑒定為陽性的菌液送北京六合華大基因股份科技有限公司測序。

1.2.3序列分析 序列比對使用DNAMAN 6完成；啟動子序列調控元件分析以植物順式調控元件數據庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)完成；數據處理使用SPSS軟件完成。

1.2.4pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達載體的構建 根據測序結果設計引物PsikFBA4-F(5′-ggatccATGAAGGCGAGATGGAGAA-3′)、PsikFBA4-R(5′-actagtGTGTGTGTAAGAAGTGAGGC-3′)在PsikFBA4序列上、下游分別引入BamHⅠ和NcoⅠ酶切位點并連入pEASY-T5載體。用BamHⅠ和NcoⅠ雙酶切pEASY-T5-PsikFBA4重組質粒和pCAMBIA1304載體，分別回收目的小片段和載體大片段，并用T4連接酶16 ℃連接過夜，將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性克隆后，凍融法轉入根瘤農桿菌GV3101，獲得陽性轉化子將其命名為pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS-GV3101。

1.2.5農桿菌介導的在煙草中瞬時轉化及GUS酶活力的測定 瞬時轉化方法參考穆建強等[10]的研究，但有所改動。將鑒定為陽性的含有重組質粒的農桿菌劃線，挑單克隆于加有相應抗生素的LB培養基中，28 ℃、200 r·min-1培養過夜；再將2 mL菌液轉入到50 mL的LB液體培養基中，相同條件下培養至OD600為0.5～0.6；3000 r·min-1離心15 min收集菌體，棄上清后用重懸液(10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1乙酰丁香酮)調整OD值為0.8左右，室溫下靜置3 h待用；取已滅菌的注射器，依靠壓力將菌液注入煙草葉片的葉脈之間，在黑暗條件下保溫、保濕培養24 h之后恢復正常光照培養24 h(16 h光照，8 h黑暗)。對所有注射過的煙草進行冷脅迫處理，處理時間為1、3、6、12和24 h；在不同處理時間點分別用打孔器取樣，分別對樣品進行GUS染色和GUS酶活力測定。

GUS染色方法參考Jefferson[11]所用的染色方法，分別將各個材料浸沒于GUS染液中，37 ℃染色16～24 h，使用無水乙醇將葉片中的綠色脫去，觀察染色結果并拍照保存。

GUS酶活力的測定參考Jefferson[11]建立的熒光定量分析法。樣品用液氮進行研磨，并使用GUS抽提液(50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液，10 mmol·L-1EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% SDS，10 mmol·L-1β-巰基乙醇)進行抽提；使用Bradford[13]的方法測定蛋白濃度；取100 μL蛋白上清加入到400 μL預熱的GUS提取緩沖液中，再加入500 μL的MUG底物，37 ℃溫浴，分別在0、15、30、45和60 min取反應混合物200 μL加入到800 μL的反應終止液中，室溫避光保存；用熒光分光光度計在激發光波長365 nm,發射光波長455 nm下，狹縫10 nm時測定不同時間點的熒光值；根據測定的熒光值和蛋白濃度計算出不同脅迫時間處理條件下GUS的酶活力值。

2 結果與分析

圖1 sikFBA4不同脅迫時間下的相對表達量Fig.1 Relative expression of sikFBA4 in low-temperature *：P<0.05；**：P<0.01；T檢驗T test.

圖2 FBA4基因Tail-PCR擴增產物電泳分析Fig.2 Analysis of Hi-Tail PCR of FBA4 M：Marker 3；2:第2輪PCR產物Product of primary PCR；3：第3輪PCR產物Product of secondary PCR；LAD1～4：PCR過程中使用的簡并引物 Degenerate primers.

2.1 sikFBA4在冷脅迫下的表達情況

以天山雪蓮GAPDH基因為內參，利用qRT-PCR法對天山雪蓮經4 ℃處理0、1、3、6、12和24 h后葉片中sikFBA4基因的相對表達量進行分析，結果如圖1所示。在經低溫處理后，sikFBA4的表達量迅速上升，并在脅迫1 h時，表達量達到最大，為正常條件下的10.47倍。在此之后，sikFBA4基因的表達量雖呈現出逐漸下降的趨勢，但整體上仍高于正常水平，在處理3、6和12 h后，其相對表達量分別為正常水平的6.13、4.01和6.36倍。在對雪蓮處理24 h之后，sikFBA4基因的表達量與正常條件下的表達量基本持平。

2.2 Hi-Tail PCR擴增產物電泳

經過3輪PCR擴增，LAD1～LAD4均有符合目標差異大小的特異性條帶(圖2)，選取大小合適，具有測序意義的條帶進行回收并連接pEASY-T5載體進行測序。測序結果表明，擴增后所得FBA4的側翼序列全長1828 bp。將測序所得序列與FBA基因序列進行比對發現，PCR所得序列3′端與FBA4基因5′端分別有60個堿基的重疊，且所得序列5′端與AC1完全重疊，說明擴增所得DNA片段為雪蓮sikFBA4基因5′端側翼序列。并將其命名為PsikFBA4。

2.3 天山雪蓮FBA4基因啟動子區域的生物信息學分析

序列經啟動子分析軟件PlantCARE分析表明：在PsikFBA4中，除含有多個真核生物啟動子必需CAAT-Box和TATA-Box元件之外，還存在許多與光照、激素以及逆境脅迫相關的調控元件(圖3)，如：冷脅迫響應元件(low temperature responsive element,LTRE)、赤霉素響應元件(GA-responsive element,TATC-box)、乙烯應答元件(ethylene-responsive element,ERE)、光響應元件(cis-acting regulatory element involved in light responsiveness,G-box)、茉莉酸甲酯響應元件(cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenes,TGACG-motif)、熱激響應元件(cis-acting element involved in heat stress responsiveness,HSE)等(表2)。

圖3 PsikFBA4主要作用元件分布Fig.3 The cis-elements distribution of PsikFBA4

調控元件Regulatory sequence序列Sequence生物學功能Biological function5UTR Py-rich stretchTTTCTTCTCT高轉錄水平的順式作用元件Cis-acting element conferring high transcription levelsACECTAACGTATT光響應中的順式作用元件Cis-acting element involved in light responsivenessARETGGTTT厭氧誘導必需的順式作用調控元件Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionBox 4ATTAAT參與光響應的保守DNA模塊的一部分Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessBox ITTTCAAA光響應元件Light responsive elementCAAT-boxCCAAT啟動子和增強子區的共同順式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCCAAT-boxCAACGGMYBHv1 結合位點MYBHv1 binding siteCGTCA-motifCGTCA茉莉酸甲酯順式調控元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessEIRETTCGACC激發響應元件Elicitor-responsive elementEREATTTCAAA乙烯應答元件Ethylene-responsive elementG-boxGACATGTGGT參與光響應的順式作用元件Cis-acting regulatory element involved in light responsivenessHSEAAAAAATTTC熱應激反應中的順式作用元件Cis-acting element involved in heat stress responsivenessI-boxATGATATGA光響應元件的一部分Part of a light responsive elementMBSCAACTG參與干旱誘導的MYB結合位點MYB binding site involved in drought-inducibilityO2-siteGATGACATGA玉米醇溶蛋白代謝調控中的順式作用調控元件Cis-acting regulatory element involved in zein metabo-lism regulationSkn-1_motifGTCAT胚乳表達所需的順式作用調控元件Cis-acting regulatory element required for endosperm expressionSp1GGGCGG光響應元件Light responsive elementTATA-boxTAAAAATAA-30區的核心啟動元件Core promoter element around -30 of transcription startTC-rich repeatsATTTTCTTCA防御和應激反應中的順式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsivenessTCT-motifTCTTAC光響應元件的一部分Part of a light responsive elementA-boxCCGTCC順式調控元件Cis-acting regulatory elementCCGTCC-boxCCGTCC與分生組織特異性激活相關的順式作用調控元件Cis-acting regulatory element related to meristem ncocific activationLTRECCGAAA參與低溫反應的順式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsivenessTCA-elementCCATCTTTT參與水楊酸反應的順式作用元件Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness

2.4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達載體的構建

用BamHⅠ和NcoⅠ雙酶切pEASY-T5-PsikFBA4重組質粒和pCAMBIA1304載體，分別回收目的小片段和載體大片段，并用T4連接酶連接過夜，將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經雙酶切鑒定成功后，轉化農桿菌GV3101，并經菌液PCR鑒定成功。

圖4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表達載體的構建示意圖Fig.4 Construction of plant expression vector pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS NOS-ter： NOS終止子NOS terminator； HygR： 潮霉素抗性基因Hygromycin； CaMV 35S： 35S啟動子35S promoter； PsikFBA4： PsikFBA4啟動子PsikFBA4 promoter； GFP： 綠色熒光蛋白Green fluorescent protein； GUS： β-葡萄糖苷酸酶基因β-glucuronidase gene.

2.5 農桿菌介導的在煙草中的瞬時表達及不同脅迫時間下酶活力的測定

以GV3101空菌株作為陰性對照，轉入pCAMBIA1304-35S-GUS質粒的菌株作為陽性對照。利用根瘤農桿菌介導法注射煙草葉片來分析PsikFBA4在低溫脅迫條件下對報告基因的誘導特性。結果表明，在陰性對照中未檢測到GUS基因的表達；在陽性對照組中明顯檢測到GUS基因的表達；在未脅迫的轉PsikFBA4-1304實驗組中檢測到少量的GUS基因的表達；在經過低溫脅迫處理后在轉入PsikFBA4-1304的實驗組中能夠明顯檢測到GUS基因的表達，且表達量隨著脅迫時間的延長有上升趨勢，GUS染色結果如圖5所示。

圖5 脅迫處理下GUS染色分析及酶活力的測定Fig.5 GUS activity of transient expression in tobacco during cold stress A:PsikFBA4-GUS-1304實驗組Experimental group;B:P35S-GUS-1304陽性對照Positive control;C:陰性對照 Native control;*:P<0.05;**:P<0.01； T檢驗T test； 4-MU： 4-甲基傘形酮4-methylumbelliferone.

GUS活性定量分析結果表明，對植株進行冷脅迫后，PsikFBA4調控下的GUS活性隨脅迫時間呈現出先增長后降低的特征。未脅迫的條件下，煙草葉片中的GUS酶活性為1.343 nmol 4-MU·min-1·mg-1；在脅迫1 h后GUS酶活力迅速上升，達到5.824 nmol 4-MU·min-1·mg-1，上升幅度約為4.33倍，在脅迫6 h時酶活力達到最大值，為10.598 nmol 4-MU·min-1·mg-1。在此之后，植株中的GUS酶活力開始出現持續的小幅度下降，并在處理24 h后達到6.874 nmol 4-MU·min-1·mg-1。與PsikFBA4相比，35S啟動子驅動下的GUS酶活性在整個脅迫過程中都表現出很高的活性，除在24 h時酶活力有所下降外，其余時間點酶活力基本相同，均維持在10.5～11.5 nmol 4-MU·min-1·mg-1(圖5)。

3 討論

溫度是植物正常生長的必要條件。低溫脅迫幾乎影響植物生命活動的全過程，尤其是光合作用受低溫影響最為顯著[12-13]。因此，培育具有抗寒特性的新品種具有十分重要的現實意義。果糖-1,6-二磷酸醛縮酶在生物體內可逆催化果糖-1,6-二磷酸(1,6 fructose diphosphate，FDP)的生物合成，是Calvin循環和糖質新生代謝過程中必不可少的一個關鍵調控酶[14]。Uematsu等[15]的研究表明，在煙草中超表達來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)質體的FBA基因，可提高轉基因煙草的光合速率，并促進轉基因煙草的生長和生物量的積累。而本實驗室在前期的工作中通過對轉sikFBA4基因的番茄(Lycopersiconesculentum)進行低溫光適應性研究發現，sikFBA4對提高番茄的抗寒性也具有顯著的作用。

實時熒光PCR結果表明，sikFBA4對冷脅迫的響應十分敏感，表達量的變化十分劇烈，在脅迫處理1 h后其表達量達到對照組的10倍左右，在此之后表達量隨著時間逐漸降低。產生這一現象的原因可能是天山雪蓮在感知冷信號之后產生應激反應，通過表達量的升高來滿足植物機體對冷脅迫的響應，而在其對低溫環境適應后，表達量逐漸下降以減少能量的損耗。sikFBA4對低溫環境十分敏感的特性，表明sikFBA4在天山雪蓮應對低溫脅迫的過程中扮演了重要的角色，而本研究的啟動子序列分析結果也顯示在PsikFBA4中確實存在著與冷脅迫等逆境相關的順式作用元件。

sikFBA4基因啟動子的克隆和分析表明，sikFBA4基因啟動子全長為1828 bp，包含有30個CAAT-Box和83個TATA-Box，除此之外還包含有多個與逆境脅迫相關的順式作用元件，如ABRE元件、ARE元件、MBS和LTRE等元件。其中，LTRE是與低溫誘導相關的轉錄因子CBFs的結合位點[16-17]，CBFs可通過與啟動子上的順式作用元件結合而啟動相關基因的表達。Jaglo等[18]通過在甘藍(Brassicaoleracea)和油菜(Brassicanapus)中表達來自擬南芥CBF1基因，使其抗寒性較野生型有明顯的提高；甄偉等[19]通過在煙草中轉入來自油菜的CBF1基因得到了抗寒性明顯提高的煙草植株。因此，植物可通過CBFs來調控下游大量抗寒相關基因的表達來提高植物的抗寒能力。ABRE是脫落酸(ABA)信號通路中的關鍵順式作用元件。植物在受到低溫脅迫時，體內的ABA含量增加[20]，而ABA含量的增加可通過ABA信號通路活化其下游的bZIP轉錄因子ABFs，ABFs可通過與ABRE的結合調控下游基因的表達[21-25]。因此推測，ABRE順式作用元件的存在可能也是sikFBA4能夠響應低溫脅迫的重要原因之一。

為了進一步驗證PsikFBA4啟動子在低溫下的誘導特性，本研究構建了以GUS為報告基因植物表達載體并在煙草中進行瞬時表達，瞬時表達后的GUS染色結果表明，經低溫脅迫后發現，在PsikFBA4的驅動下GUS基因的表達量在未脅迫的情況下僅有少量的表達，而在經過低溫脅迫后GUS基因的表達量有了顯著的升高。之后的GUS酶活力測定結果與瞬時表達后的染色結果基本一致，表明PsikFBA4具有在低溫條件下誘導報告基因表達的能力，并進一步證明了PsikFBA4是一種低溫誘導型啟動子。

干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫因素能夠誘導植物體內相關基因的表達，這一調控過程的主要機制就是逆境脅迫相關的轉錄因子與基因上游的啟動子關鍵順式作用元件結合，增強啟動子的活性從而提高相關目的基因的表達量。在當前的轉基因工程中，廣泛使用的是組成型啟動子，但由于組成型啟動子能夠驅動目的基因在植物的各個組織中恒定而持續的表達，而不能從空間和時間上有效的調控目的基因的表達，從而過度的消耗植物中的物質和能量造成不必要的浪費，并最終影響到植株的正常生長發育。孟慧等[26]在擬南芥中過量表達玉米ABP9基因后發現，與野生型相比，ABP9過量表達的植株在種子萌發，幼苗的生長以及開花階段的生長均受到抑制，同時葉片內源ABA含量降低，ABA信號傳導基因表達增強而ABA合成基因表達降低，表型受到嚴重的影響。而誘導型啟動子的利用，則可能實現對外源基因的時、空、量的三維表達調控，在提高植物抗逆特性的基礎上保證植物的正常發育。因此具有經濟、環保及生物安全等多方面的潛在價值。因此，相對于組成型啟動子而言，誘導型啟動子具有更高的實際研究價值。在本實驗中，以具有良好抗寒特性的天山雪蓮為材料，分離出果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因FBA4的上游啟動子序列，并通過實時定量PCR和在煙草中的瞬時表達確定其為低溫誘導的啟動子，為進一步研究天山雪蓮的抗寒機制奠定了基礎。

4 結論

本實驗通過實時熒光定量PCR技術分析了天山雪蓮果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因sikFBA4在低溫脅迫下的表達模式，并分離出sikFBA4基因的上游啟動子序列進行生物信息學分析。結果發現，在低溫脅迫的條件下，sikFBA4基因的表達量顯著升高，在其上游啟動子序列中存在低溫應答元件LTRE。接下來構建了PsikFBA4與GUS基因的融合表達載體并在煙草中進行瞬時表達，GUS染色和酶活力測定的結果顯示在經過低溫處理之后GUS基因的活性顯著增強，表明PsikFBA4能夠在低溫脅迫誘導的條件下驅動下游基因的表達，為冷誘導型啟動子。為對天山雪蓮sikFBAs基因的表達調控機制進行進一步的研究，接下來要對PsikFBA4啟動子進行系列缺失分析，通過構建不同長度的缺失表達載體導入煙草進行功能驗證從而確定其核心啟動子區域。同時構建植物表達載體PsikFBA4-sikFBA4和P35S-sikFBA4導入煙草，比較不同類型啟動子驅動下外源基因的導入對植物生理指標的影響，以期對抗寒植物的培育做出貢獻。