I型組蛋白去乙酰化酶抑制劑在阻斷軟骨退化中的作用

顧霄鵬，巢海潮，顧岳全

（1.浙江大學舟山醫院 骨科，浙江 舟山 316101；2.江西省人民醫院 分子生物實驗室，江西 南昌330006；3.舟山顧鶴傳骨傷醫院 正骨科，浙江 舟山 316101）

關節炎（osteoarthritis，OA）是骨科最常見的疾病之一，也是多種骨關節疾病常見的共同病理表現，其發病機制復雜，治療缺乏特異并行之有效的辦法，治療效果難以把控。現有研究證實OA的病因主要是軟骨細胞被破壞。軟骨破壞是基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和聚集蛋白聚糖酶（aggrecanase，ADAMTS）家族中蛋白酶共同介導的結果[1]。軟骨細胞是OA關節內MMP表達的主要來源，MMP的增多是通過組蛋白乙酰基轉移酶和組蛋白脫乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）家族中的酶催化蛋白乙酰化反應產生的[2]。這些酶不僅可以調節DNA和組蛋白核小體的相互作用，同時也能使細胞核和胞質蛋白都逆乙酰化，最終導致關節功能發生改變[3]。提示組蛋白乙酰化修飾在OA關節軟骨退化過程中發揮了關鍵作用，但其具體機制不明。

本研究通過內側半月板不穩術（destabilization of the medial meniscus，DMM）構建SD大鼠OA模型，選取廣譜性HDAC抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）進行體內干預，觀察TSA對軟骨退化的影響。選取TSA及選擇性HDAC抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）和MS-275，并驗證各抑制劑的活性；體外培養人源性關節軟骨細胞（human articular chondrocyte，HACs）及軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用以上HDAC抑制劑及I型HDAC各亞型特異性siRNA，并結合MMP誘導劑白細胞介素-1α（IL-1α）干預，觀察各HDAC亞型抑制對細胞MMP表達的影響。進一步利用外植體軟骨退化（PNC外植體）試驗，驗證各HDAC亞型抑制劑對軟骨退化的影響。探討I型HDAC抑制劑在阻斷軟骨退化中的作用，并初步揭示其可能作用機制，為OA關節軟骨退化的治療及相關研究提供理論基礎和思路。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠購自長沙天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。HDAC抑制劑（TSA、VPA、MS-275）均購自美國圣克魯斯生物技術公司。重組IL-1α和制瘤素M（oncostatin M，OSM）購自上海拜力生物科技有限公司。抗總組蛋白H3、抗乙酰化組蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙酰化組蛋白H4均購自上海研生實業有限公司。抗總α-微管蛋白和抗乙酰化的α-微管蛋白購自美國Abcam公司。人軟骨肉瘤細胞系SW-1353購自美國模式培養物集存庫。GlutaMAX和鏈霉素購自美國Gibco Invitrogen公司。莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶購自美國Invitrogen公司。核糖核酸酶抑制劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 OA模型制備及TSA干預：10只9周齡大小的SD大鼠在正常飲食標準籠中飼養，隨機分為2組，手術組和假手術組，每組5只。手術組大鼠行DMM，構建OA模型[4]；假手術組大鼠亦行手術干預，但不破壞內側半月板穩定性，其他均同手術組。術后常規飼養大鼠，并以1 mg·kg-1·d-1的TSA劑量全身給藥，給藥途徑為皮下植入滲透泵注入。8周后處死大鼠，對其膝關節行組織學檢查和評估。

1.2.2 細胞培養：從舟山顧鶴傳骨傷醫院骨科收治的并接受膝關節置換手術的OA患者中提取HACs，這一試驗獲舟山顧鶴傳骨傷醫院倫理委員會批準，并經患者簽署知情同意書。HACs及人軟骨肉瘤細胞系SW-1353分別在含有10%胎牛血清的GlutaMAX培養基及DMEM培養基中培養，培養基中常規加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養條件為37 ℃、5%CO2、恒濕培養箱。

1.2.3 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平：SW-1353細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，隨后去血清饑餓12 h，再分別行不同濃度的TSA、VPA、MS-275處理6 h。其后，冰上用PBS洗滌2次，收集各組細胞，加入裂解液冰上充分裂解0.5 h，制備細胞總蛋白。采用BCA法測定各樣本蛋白濃度。按照說明書及目的蛋白分子量配置相應濃度的SDS-PAGE電泳凝膠，其后依次進行電泳、轉膜、封閉、一抗（抗總組蛋白H3、抗乙酰化組蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙酰化組蛋白H4、抗總α-微管蛋白和抗乙酰化的α-微管蛋白）孵育，4 ℃搖床過夜；次日回收一抗后進行二抗孵育1 h；再用TBST洗膜5次，每次5 min；洗膜后采用ECL法顯影定影。根據各條帶灰度值，分別計算目的蛋白的相對表達量，設置3次重復實驗。

1.2.4 HDAC抑制劑干預試驗：體外培養SW-1353細胞系和HACs，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理，分別加不同濃度的HDAC抑制劑（TSA、VPA及MS-275）干預進行分組，均干預處理6 h。其后，細胞在冰上用PBS洗滌2次，并用TRIzol試劑提取出各組細胞總RNA，備用。

1.2.5 siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達：體外培養SW-1353細胞系，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理設置實驗組和對照組；根據I型HDAC各亞型（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）特異性siRNA（siH1、siH2、siH3、siH8）再進行亞分組。根據siRNA說明書進行細胞轉染，以非靶向控制的siRNA為陰性對照，所采用的引物序列見表1。細胞轉染后，通過RT-PCR驗證I型HDAC

表1 I型HDAC各亞型siRNA引物序列

表2 RT-PCR實驗中I型HDAC各亞型引物序列

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism4.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析、Bonferroni校正多重比較等。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSA對OA關節軟骨退化的影響 通過DMM構建SD大鼠OA模型，術后8周處死大鼠，通過組織學評分進行OA評估，結果顯示手術組OA大鼠較假手術組大鼠軟骨病變主要集中在脛骨內側平臺的中央承重區域，較小部分在股骨內側髁[14]，提示造模成功，符合實驗要求。以1 mg·kg-1·d-1劑量的TSA全身給藥，關節軟骨番紅O染色結果顯示：給藥干預后的OA大鼠較干預前其脛骨內側平臺及股骨內側髁的軟骨損傷有所減輕（見圖1A）；組織學評分結果顯示脛骨內側平臺的軟骨損傷較干預前有所減輕，差異具有統計學意義（P=0.015），見圖1B。

2.2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平 TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平（P＜0.05），并呈濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預各亞型表達干擾情況，引物序列見表2。

1.2.6 外植體軟骨退化試驗：將軟骨盤孵育于37 ℃，5% CO2的濕潤空氣中24 h，之后將培養基更換為含有細胞因子和（或）HDAC抑制劑無血清DMEM，實驗重復4次。在第7天收集上清液，并且將外植體培養直到第14天，收集剩余的軟骨和培養基。剩余的軟骨外植體在65 ℃木瓜蛋白酶中消化過夜，檢測羥脯氨酸的釋放量作為膠原降解[5]的測度量，檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的釋放量作為蛋白多糖降解[6]的測度量。于當天、第1天、第3天、第8天和第10天收集上清液和軟骨樣本，提取軟骨RNA，儲存于RNAlater置于-80 ℃備用。

1.2.7 RNA提取及cDNA合成：使用TRIzol純化收集細胞或組織的總RNA，測定RNA濃度及純度。使用RNeasy Mini試劑盒進行cDNA合成，根據試劑盒說明合成cDNA。將合成物存儲于-20 ℃備用。以cDNA為模板，PCR試劑盒說明步驟進行PCR擴增，反應程序設定如下：預變性95 ℃ 30 s，循環參數：95 ℃30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，40個循環，72 ℃延伸8 min。采用相對定量2-ΔCt法計算各基因的相對表達量。濃度越高，組蛋白乙酰化水平越高，HDAC抑制劑的活性越高。見圖2。

圖1 關節軟骨番紅O染色（A）及組織學評分（B）觀察TSA對OA關節軟骨退化的影響

2.3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達 TSA、VPA及MS-275可顯著抑制HACs細胞中IL-1α誘導的MMP1及MMP13 mRNA的表達（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預濃度越高，MMP1及MMP13 mRNA的表達越被抑制。見圖3。

2.4 采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達siRNA特異性干擾處理后，I型HDAC各亞型mRNA表達水平表達下調率為HDAC-1 83%，HDAC-2 89%，HDAC-3 63%，HDAC-8 77%。HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，SW-1353細胞中基礎的MMP13表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4A；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1α誘導的MMP13的表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4B。

2.5 HDAC抑制劑對OSM誘導的GAG和膠原蛋白產生的影響 以不同濃度HDAC抑制劑處理細胞，檢測GAG和膠原蛋白。結果顯示：TSA、VPA及MS-275可顯著抑制軟骨細胞中GAG和膠原蛋白的產生（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預濃度越高，其抑制作用越強。見圖5。

圖2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平

圖3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達

圖4 siRNA特異性干擾SW-1353細胞中I型HDAC各亞型表達對MMP13 mRNA表達的影響

圖5 HDAC抑制劑對軟骨細胞中OSM誘導的GAG和膠原蛋白生成的影響

3 討論

TSA為一種廣譜HDAC抑制劑，在炎癥性OA模型中具有抗關節退化作用。使用TSA干預后可觀察到動物模型關節損傷減少與細胞因子表達降低，細胞周期調節子p16INK4a和p21WAF/Cip1表達增加，這與IL-1和（或）腫瘤壞死因子α的表達減少相關[2，7]。此外，在膠原誘導的OA軟骨中，TSA通過差動調節Th1和Th2細胞[8]并減少關鍵MMP的表達，如MMP-3和MMP-13，阻遏疾病進展并改善疾病狀況[9]。在關節腔內注射TSA，可減少前交叉韌帶切斷的兔OA模型的關節損傷，同時伴有MMP1、MMP3、和MMP13表達降低[2]。說明HDAC抑制劑在OA關節中發揮了重要的調控作用。本研究通過DMM構建SD大鼠OA模型，選取TSA進行體內干預，觀察TSA對軟骨退化的影響；結果顯示TSA可明顯減輕OA模型SD大鼠脛骨內側平臺及股骨內側髁的軟骨退化程度，驗證了HDAC抑制劑在OA中具有抗軟骨退化的作用。

軟骨細胞是OA關節內MMP表達的主要來源， MMP的增多是通過組蛋白乙酰基轉移酶和HDAC家族中的酶催化蛋白乙酰化反應產生的[2]。為了進一步探究HDAC抑制劑抗軟骨退化的作用機制，本研究選取廣譜HDAC抑制劑TSA及選擇性HDAC抑制劑VPA和MS-275進行干預軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平，驗證各HDAC抑制劑的活性。有研究表明，在哺乳動物膠原誘導的關節炎模型中，MS-275能阻止疾病進展和關節破壞[10]。然而，這個HDAC抑制劑尚未在OA的模型中進行測試。本研究結果發現TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平，并呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預濃度越高，組蛋白乙酰化水平越高，HDAC抑制劑的活性越高。TSA可以劑量依賴性地誘導α-微管蛋白的乙酰化，而丙戊酸和MS-275不會，這表明只有前者能抑制軟骨細胞中HDAC-5和（或）HDAC-6的活性[11-12]，說明各HDAC抑制劑可能是通過抑制不同的HDAC亞型發揮藥理作用的。

MMP1及MMP13是人關節軟骨細胞中參與軟骨破壞的關鍵膠原酶。本研究進一步采用外源性IL-1α誘導HACs細胞MMP1及MMP13表達，結合不同濃度的TSA、VPA及MS-275處理，發現各HDAC抑制劑可顯著抑制HACs細胞中MMP1及MMP13的表達，并亦呈濃度依賴性；即TSA、VPA及MS-275干預濃度越高，MMP1及MMP13的表達越被抑制。提示各HDAC抑制劑可能是通過抑制HDAC乙酰化，減少MMP1及MMP13的表達，進而發揮保護軟骨退化的藥理作用的。

HDAC抑制劑也能調節很多軟骨基質分子的表達，但調節機制比較復雜，因為軟骨細胞的HDAC抑制劑短期治療（＜24 h）會誘導基因表達的合成代謝[13]，而延長治療會抑制許多轉錄樣本[14]。早期的影響可能是HDAC抑制作用的直接后果，因為HDAC-1、HDAC-2的過表達能抑制ACAN和COL2A1的表達[13]。表明這種抑制是由HDAC的C-末端結構域介導的。本研究采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達，發現HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，軟骨肉瘤細胞SW-1353中基礎的MMP13表達明顯下降；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1誘導的MMP13的表達水平明顯下降。提示HDAC各亞型中發揮關節炎調控作用的主要是I型。

HDAC抑制劑的軟骨保護特性，可通過在OA體內模型中觀察到的關節損傷減少來支持，并且可作為HDAC抑制劑治療的結果[15]。現鮮有明確的HDAC抑制劑介導的細胞因子誘導MMP表達的報道。雖有研究表明TSA和丁酸鈉復合物可抑制HDAC的大部分家族經典成員（除丁酸鈉對HDAC-6外），但目前尚不明確哪種HDACs與MMP表達及OA的進展有關[16]。能有效緩解OA的治療藥物較少，疾病末期患者唯一有效的治療方法是全關節置換[17]。廣譜HDAC抑制劑的軟骨保護作用表明，經典的HDACs在MMP表達的調

控中發揮重要作用，在OA中也可能如此。雖然廣譜HDAC抑制劑對人類的毒性作用沒有化療藥物大，但仍不適合用于治療慢性疾病[18-19]。為了表明哪種HDACs是廣譜抑制劑軟骨保護作用的主要目標，本研究采用2種已知的選擇性抑制劑：VPA和MS-275，與TSA在細胞單層和豬的鼻軟骨外植體試驗中進行比較。結果證實I型HDAC（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）被抑制劑抑制或I型HDACs特異性消耗均能抑制軟骨細胞MMP1及MMP13的表達，抑制PNC外植體GAG和膠原蛋白水平，說明I型HDAC抑制劑可能是通過抑制MMP、GAG和膠原蛋白的表達而發揮對軟骨退化的保護作用。