攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的Leber遺傳性視神經病變家系臨床與遺傳學分析

梁敏，侯玲玲，姜豐，管敏鑫

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035）

Leber遺傳性視神經病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種線粒體遺傳性視神經疾病，主要發病人群為青年男性，發病年齡常在17～30歲[1-2]。眼科檢查主要表現為雙眼視力同時或先后下降，可有視野缺失或色覺障礙[3-5]。線粒體DNA（mtDNA）3個原發突變是LHON發病的分子基礎[6-9]，線粒體新突變位點和繼發突變位點在LHON的發病過程中起重要作用[10-13]。本研究主要對6個攜帶線粒體基因3497C＞T（m.3497C＞T）突變的LHON家系進行家系調查，對6例先證者進行了詳細眼科學檢查及線粒體基因組測序，并分析了m.3497C＞T突變對線粒體呼吸鏈復合物酶活性的影響。

1 對象和方法

1.1 對象 對6個攜帶m.3497C＞T突變的LHON家系進行家系調查，對家系先證者進行發病情況詢問，并進行詳細的眼科檢查。選取無血緣關系的2名正常人作為正常對照，抽取先證者和正常對照者EDTA-K抗凝靜脈血10 mL，其中5 mL用于建立轉線粒體細胞系，其他用于提取全基因組DNA，-80 ℃保存。本研究經溫州醫科大學倫理委員會批準，參與本研究的患者家系及正常對照人群均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科學檢查：對6個家系先證者進行臨床眼科檢查，包括標準對數視力表檢測視力，眼底鏡，Canon CR6-45NM眼底照相機，光學相干斷層掃描儀（OCT檢查儀，德國Heidelberg公司）。雙眼視力損傷參照WHO（http://www.who.int/en/）標準：正常≥0.3；0.1≤輕度損傷＜0.3；0.05≤中度損傷＜0.1；0.02≤重度損傷＜0.05；極重度損傷＜0.02。

1.2.2 線粒體基因組檢測與分析：將6例家系先證者和2例正常對照者經EDTA-K2抗凝的全血用經典的酚/氯仿法提取全基因組DNA，NanoDrop1000測定濃度，-80 ℃保存備用。使用24對有部分重疊的正反向引物（引物可完全覆蓋整個線粒體基因組序列）對6例家系先證者及對照者線粒體全基因組進行擴增，PCR產物使用AxyPrep PCR Clean-up Kit純化后送杭州擎科生物科技有限公司測序。通過統計突變位點在正常對照者中的發生頻率、線粒體多肽、rRNA或tRNA二級結構定位及種系發育分析等分析mtDNA其他突變位點致病性并確定其線粒體單體型。

1.2.3 轉線粒體細胞系的構建及呼吸鏈復合物酶活力的分析：對6例先證者和2例正常對照者通過EB病毒轉化建立人類永生化外周血淋巴母細胞系，按照King和Attardi方法建立轉線粒體細胞系[14]，在含有單個克隆的培養皿內分離出狀態穩定的細胞。按照常規酚-氯仿方法分別提取轉線粒體細胞的DNA，檢查其基因型，以證實所得到轉線粒體細胞的線粒體來自相應的淋巴細胞。大量提取細胞線粒體，并進行線粒體蛋白濃度測定，進行線粒體呼吸鏈復合體酶活性的測定，評估m.3497C＞T突變對線粒體呼吸鏈復合物酶活力的影響。

2 結果

2.1 攜帶m.3497C＞T突變LHON家系的家系調查 6個LHON家系共158名成員，其中母系成員100名。每個家系都只有1名成員發病，6例患者中男性患者5例，女性患者1例，外顯率分別為5%，6.25%，6.25%，4.76%，5.88%，10%。除LHON表現外，臨床檢查均未發現其他臨床病癥。見圖1。

圖1 6個攜帶m.3497C＞T突變位點家系的家系圖（黑色代表患者，箭頭代表先證者）

2.2 攜帶m.3497C＞T突變的先證者臨床資料分析及眼科學檢查 6例先證者中包含1例女性和5例男性，最小發病年齡7歲，最大37歲。2例重度視力損失，1例中度視力損失，3例輕度視力損失，見表1。眼底檢查先用直接檢眼鏡檢查，然后用眼底照相機拍照，如圖2所示，患者主要表現為視盤色淡，邊界不清，周圍小血管迂曲。2例重度視力損傷患者中，LP002-IV-2患者表現為視盤顳側色淡，小血管迂曲擴張，LP004-III-11患者雙眼視盤顳側色淡，邊界不清。利用OCT對6例先證者視網膜神經纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度測量發現，LP002-IV-2患者RNFL在左眼的鼻側和顳側象限、右眼顳側象限明顯變薄，LP004-III-11患者雙眼顳側象限RNFL厚度明顯變薄，其余4例患者RNFL厚度無明顯變化，見圖3。

2.3 攜帶m.3497C＞T突變的先證者線粒體全基因組分析 對6例攜帶m.3497C＞T突變的先證者行線粒體全序列分析，如表2所示，共發現74個變異位點，進一步分析顯示這些突變均為同質性突變，包括67個已報道的和7個未報道的位點[15]。其中錯義突變12個（10個已報道，2個新突變），并未發現與LHON相關的ND4基因11778G＞A，ND6基因14484T＞C，ND1基因3460G＞A三個原發突變位點。這些先證者線粒體單體型分別屬于B4c1b、B4c1b、N9a4、B4c1、B4c1b和B4c1b2。

表1 攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的6例先證者臨床資料

圖2 6例先證者眼底表現

2.4 攜帶m.3497C＞T突變的細胞株酶活力分析為了確定m.3497C＞T突變對線粒體氧化呼吸鏈各復合體活性的影響，測定攜帶m.3497C＞T突變的先證者和同屬B單體型的正常對照樣本（正常對照-1和正常對照-2）各復合體的酶活性。通過將復合體I、復合體II、復合體III和復合體IV的酶促反應速率以檸檬酸合酶的酶促反應速率為標準進行標準化，計算不同復合體樣本間的相對酶活性[16]。研究顯示，攜帶突變的患者復合體I的活性平均降低12.4%。各個細胞株復合體II、復合體III和復合體IV活性差異均無統計學意義（見圖4）。

圖3 6例先證者OCT檢查結果

表2 攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的6例先證者線粒體全序列分析

續表2

3 討論

LHON最常累及青壯年男性，視力下降往往是突發性且永久性的，也難以矯正，這給患者帶來了極大的痛苦。mtDNA 3個原發突變位點是LHON發病的分子基礎，線粒體繼發突變位點在LHON的發病過程中起著重要作用[10-13]。

圖4 線粒體氧化呼吸鏈復合體酶活性的檢測

本研究主要對6例攜帶m.3497C＞T突變位點的LHON家系進行調查，對6例先證者進行了詳細的眼科學、分子和生化功能分析，這6例患者的發病年齡平均是20歲，這與其他攜帶m.11778G＞A突變的LHON家系一致[17]，然而這6個家系中，都只有一個成員患病，發病率顯著低于攜帶三個原發突變的高加索人群[18]。我們對6例先證者進行眼底檢查發現，這6例患者眼底均有不同程度的改變，部分患者眼底全部或部分蒼白，符合視神經萎縮期的表現，也有部分患者視盤周圍血管迂曲，視網膜水腫，為急性期表現[19]。研究顯示，RNFL厚度在顳側變化比較明顯，顳側纖維是最早和受累最嚴重的纖維，發病早期或臨床前期，顳側視盤黃斑束纖維水腫導致RNFL厚度增加，當病程超過6個月時，LHON處于萎縮期，此時，RNFL的厚度在各象限均變薄[20-24]。本研究中的2例重度視力損傷患者，其RNFL厚度已經明顯變薄，而其他4例患者RNFL厚度無明顯變化。

我們對6例先證者線粒體基因組全序分析發現均攜帶m.3497C＞T突變，該突變為已報道的與LHON相關的繼發突變位點[18]。此外，m.3635G＞A、m.T12338T＞C、m.T14502＞C突變也能增加由m.G11778＞A突變所致LHON的臨床表型[10，13，16]。此外，我們還發現了7個未報道的位點，分別為：D-Loop區268C＞T突變位點；ND1基因3435C＞T、3488T＞C、3632C＞T突變位點；ND2基因5057C＞T突變位點；NC區5895DelC突變位點和ND3基因10250A＞G突變位點。D-Loop區和NC區為非編碼區，ND1基因3435C＞T，ND2基因5057C＞T和ND3基因10250A＞G突變位點突變后，并沒有造成氨基酸的改變，故認為以上幾種突變位點不是LHON表型發生的主要原因[25]。進一步對ND1基因3488T＞C和3632C＞T突變位點種系發育分析顯示，在種族發育過程中這兩個位點的保守型均＞75%[25]，可能協同m.3497C＞T突變位點致病。有研究顯示，線粒體單體型B可能增加耳聾及高原型肺水腫的發病風險[26-27]。單體型D4j和M9a等在LHON的發病中起著重要作用[28-30]，這6例先證者線粒體單體型中5例為B4c型，我們推測單體型B4c可能協同影響LHON的發病。

ND1基因3635G＞A突變引起的線粒體蛋白質合成障礙導致線粒體氧化呼吸鏈復合體損傷，引起呼吸鏈復合物酶活性的改變，并直接影響了氧化呼吸效率[13]。本研究對6例攜帶m.3497C＞T突變的轉線粒體細胞株呼吸鏈復合物酶活性分析發現，突變的細胞株其復合物I酶活性為對照細胞株的87.61%，各個細胞株復合體II、復合體III和復合體IV活性無顯著差別，這說明m.3497C＞T突變影響了呼吸鏈復合物I的酶活性。

隨著研究手段的增加，越來越多的新位點及繼發位點的功能進一步得到驗證，使得LHON的發病機制得到進一步闡明。本研究對攜帶m.3497C＞T突變的患者臨床表型分析、眼底檢查以及生化功能研究，結果均提示m.3497C＞T突變是這些家系發病的主要原因。因此，可將m.3497C＞T突變作為LHON易感人群的篩查位點，對攜帶該突變的攜帶者進行及時宣教并進行有效地預防。