急性和慢性低O2高CO2大鼠海馬線粒體生物合成改變及其與認知障礙的關系

閔晶晶，顧群，陳琪，王小同

（1.湖州市第一人民醫院 神經內科，浙江 湖州 313000； 2.湖州市第一人民醫院 腎內科，浙江 湖州313000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 康復科，浙江 溫州 325027）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的呼吸系統疾病。研究顯示COPD患者在表現肺功能障礙的同時，還存在著不同程度的認知功能障礙[1-2]。慢性低O2高CO2是COPD發生發展的重要病理機制之一，我們在前期的研究中也發現慢性低O2高CO2模型大鼠存在著不同程度的學習記憶障礙，且與氧化應激、炎癥、凋亡和線粒體損傷等密切相關[3-6]。線粒體生物合成是指在核DNA和線粒體DNA兩大基因組的協同作用下，細胞內新的線粒體的合成過程。其過程非常復雜：除了合成mtDNA編碼的蛋白外，還包括合成新的細胞器結構（包括合成和輸入核編碼的蛋白），組裝雙基因來源的衍生蛋白和mtDNA的復制[7]。過氧化物酶增殖激活受體輔助激活物1α（peroxisome proliferator-acti-vated re-ceptor γ coactivator-1α，PGC-1α）在線粒體生物合成中起著主導作用，它可以輔助激活核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factors 1/2，NRF1/2）的轉錄，并作為線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的啟動子，啟動線粒體生物合成，調控mtDNA的復制和轉錄[8-9]。研究發現神經元退行性疾病的發生與線粒體合成障礙密切相關，在阿爾茨海默病患者的神經元細胞中存在著mtDNA的缺陷，并可導致線粒體電子傳遞鏈復合體COX的功能障礙[10]。本研究通過建立急慢性低O2高CO2大鼠模型，觀察大鼠學習記憶能力變化及海馬區線粒體形態改變，檢測PGC-1α、NRF-1、TFAM線粒體生物合成蛋白表達情況及mtDNA的含量，進一步探討急慢性暴露方式對大鼠學習記憶及線粒體生物合成水平的影響及可能相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器：低O2高CO2氧艙（長沙華曦電子科技有限公司），Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司），壓縮性高純度N2、壓縮性高純度CO2（溫州申鹿公司），透射電鏡（日本Hitachi公司），PGC-1α抗體、NRF-1抗體、TFAM（美國Santa Cruz Biotechnology公司），PVDF膜（德國Millipore公司），實時熒光定量PCR儀、SYBR Green染料（德國Roche公司）。ECL發光液、HRP標記的山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗（杭州自弗德生物科技有限公司）。BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。Solution I配置：取0.5 mol/L EDTA 2 mL，1 mol/L Tris-HCl 2.5 mL，20%葡萄糖4.5 mL，用DDW定容為100 mL，高溫高壓滅菌后，4 ℃保存；每次使用前每50 mL的Solution I中加入2 mL的RNase A（20 mg/mL）。

1.1.2 實驗動物：48只SPF級雄性SD大鼠，體質量200～230 g，購自上海斯萊克公司，動物許可證號：SCXX（滬）2007-0005。按隨機數字表法隨機分為3組：對照組、急性組、慢性組，每組各16只。

1.2 方法

1.2.1 動物造模：急性組、慢性組大鼠置于常壓低O2高CO2氧艙內進行造模（O2濃度為9.0%～11.0%，CO2濃度為5.0%～6.0%），每天8 h，急性組造模3 d，慢性組造模4周，每周6 d；其余時間同對照組，于正常環境中（室溫20～23 ℃，相對濕度50%～70%）飼養，自然光照，大鼠可自由獲得食物和飲水。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：連續進行5 d，每天3次。水迷宮由一個直徑1.7 m、深40 cm的圓形水池組成，分為4個象限，水池里面有約36 cm深的黑色墨汁水，水溫維持在26 ℃左右。將大鼠頭朝池壁，分別從4個象限任選一個放入水中，若60 s后仍不能找到平臺，則系統自動默認潛伏期為60 s，在第1、第2天若未找到則將其引導至平臺停留10 s，第3天開始不再引導。第6天進行平臺搜索實驗，將平臺撤去，任選一個象限將大鼠放入水，其后2組大鼠均從該象限入水，觀察并記錄60 s內大鼠穿越平臺的次數。

1.2.3 動物取材：將大鼠經6%水合氯醛腹腔麻醉，0.9%氯化鈉溶液快速心臟灌注將血液沖凈后，置于冰盤上取腦，快速分離海馬-80 ℃冰箱保存。電鏡標本經0.9%氯化鈉溶液快速灌注后需4 ℃的4%多聚甲醛灌注固定再取海馬。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體：取大鼠海馬切成1 mm3的小塊，戊二醛磷酸緩沖液固定，常規脫水、浸透、包埋、染色，制成超薄的切片，在透射電鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測蛋白含量：從-80 ℃冰箱取出大鼠海馬組織稱重，加入含1 mmol/L PMSF和1 mmol/L組織裂解液（RIPA）300～500 μL，RIPA:PMSF=99:1，放入研磨管充分研磨，置冰上裂解20 min，使充分裂解。轉移至1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r/mim離心5 min。超聲裂解3次，每次5 s。低溫高速離心機4 ℃，12 000 r/mim 離心20 min，取上清，分裝，-80 ℃保存。留1管用BCA蛋白濃度試劑盒測濃度。加雙蒸水及Loading buffer配置成上樣體系。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的大鼠海馬蛋白質并轉移至PVDF膜，在室溫下用5%無脂奶粉將PVDF膜封閉2 h。然后將膜與各自的一抗在4 ℃溫育過夜，PGC-1α一抗（1:100），NRF-1、TFAM一抗（1:500），TBST洗膜5 min×6次，加HRP標記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1:5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×6次，用ECL發光液覆蓋膜（每張約60 μL），曝光后進行分析計算。

1.2.6 RT-PCR檢測mtDNA：將海馬標本從-80 ℃冰箱取出，再加入4 mL 4 ℃預冷的Solution I，研磨管勻漿；勻漿液轉移至EP管，4 ℃，500 r/mim離心5 min；取上清液，4 ℃ 800 r/mim離心10 min。然后根據QIAGEN DNA（德國QIAGEN公司）提取試劑盒說明書進行線粒體DNA提取。檢測線粒體DNA濃度后嚴格按照試劑盒要求進行qPCR反應液的配制，線粒體DNA拷貝數以線粒體編碼基因細胞色素b的拷貝數為代表。引物序列：上游5’-AAAGCCA CCTTGACCCGATT-3’，下游3’-GATTCGTAGGGCCGCGAT A-5’，以β-actin作為內參，引物序列：上游5’-AGTG TGACGTTGACATCCGTA-3’，下游3’-CCAGAGCAGTAATCT CCTTCT-5’。反應條件：預變性：95 ℃，120 s，1個循環；擴增：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40個循環；溶解：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，共1個循環；冷卻：40 ℃ 30 s，共1個循環，采用△CT法計算mtDNA的相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計分析軟件，所有數據以±s表示。水迷宮潛伏期采用水迷宮重復測量數據的方差分析，其他數據組間比較均采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮檢測低O2高CO2對大鼠學習記憶的影響 圖1顯示了各組搜索平臺的路線。與對照組比，急性組大鼠每天訓練的逃避潛伏期和游泳距離差異無統計學意義（P＞0.05）；慢性組的逃避潛伏期（P＜0.01）和游泳距離明顯長于對照組（P＜0.05）。在水迷宮實驗第6天的空間探索實驗中，與對照組比，急性組穿越平臺次數差異無統計學意義（P＞0.05），慢性組穿越平臺次數較急性組顯著減少（P＜0.05）。見表1。

2.2 透射電鏡觀察低O2高CO2對海馬區線粒體形態的影響 透射電鏡觀察顯示對照組線粒體雙層膜結構完整，嵴清晰，內容物飽滿。急性組大鼠海馬區線粒體雙層膜完整，結構尚清晰，而慢性組大鼠海馬區線粒體膜出現腫脹，膜模糊不清，部分膜破裂，線粒體空泡變，嵴紊亂或疏松溶解，部分消失。見圖2。

圖1 各組大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺的路線圖

表1 Morris水迷宮實驗逃避潛伏期、游泳距離、穿越平臺次數比較（每組16只，±s）

表1 Morris水迷宮實驗逃避潛伏期、游泳距離、穿越平臺次數比較（每組16只，±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 逃避潛伏期（s） 游泳距離（m） 穿越平臺次數對照組 24 063.39±3 772.68 14.57±2.24 3.91±1.16急性組 25 106.33±4 741.03 14.98±2.31 3.87±1.46慢性組 28 077.12±4 575.77a 17.87±2.70b 2.63±1.06a

2.3 低O2高CO2對海馬區線粒體生物合成相關蛋白表達影響 Western blot結果顯示急性組大鼠海馬PGC-1α蛋白水平較對照組明顯增加（P＜0.01），其下游級聯蛋白NRF-1和TFAM蛋白表達均較對照組表達增加（P＜0.05）；慢性組PGC-1α、NRF-1、TFAM表達較對照組減少（P＜0.01）（見圖3、表2）。

2.4 低O2高CO2對海馬區mtDNA拷貝數影響 實時定量PCR結果顯示，急性組mtDNA拷貝數（1.879±0.234）較對照組（0.998±0.002）增加（P＜0.01），慢性組mtDNA拷貝數（0.598±0.178）較對照組減少（P＜0.05）。

3 討論

線粒體功能障礙是退行性疾病的一個重要特點。細胞內的線粒體并非靜止，其一直處于融合與分裂的動態變化之中。線粒體的平均壽命只有10 d左右，所以通過線粒體生物合成補充新的線粒體對于組織正常功能及應激條件下細胞的適應性至關重要。線粒體生物合成過程受到細胞內外多個蛋白及信號通路的調控。有研究發現亨廷頓舞蹈病的患者出現了PGC-1α及其下游因子的下調[7]，而使用了重組人線粒體轉錄因子A（recombinant-human mitochondrial transcription factorA，rhTFAM）的小鼠在旋轉棒上跑的距離是對照組的2倍[11]。

圖2 透射電鏡觀察各組海馬區線粒體結構改變（箭頭所指為線粒體）

圖3 各組海馬組織PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表達電泳圖

表2 3組大鼠海馬區線粒體生物合成相關蛋白表達（每組16只，±s）

表2 3組大鼠海馬區線粒體生物合成相關蛋白表達（每組16只，±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 PGC-1α NRF-1 TFAM對照組 1.609±0.261 1.076±0.169 1.064±0.142急性組 2.804±0.153b 2.016±0.129a 1.853±0.097a慢性組 0.751±0.186b 0.627±0.133b 0.673±0.094b

PGC-1α是調節線粒體生物合成的重要轉錄因子，其通過激活NRF1/2，進而成為TFAM的啟動子，從而啟動線粒體基因的轉錄和復制。NRF-1的轉錄活性與許多核基因編碼的線粒體呼吸鏈復合物，亞鐵血紅素生物合成的酶，蛋白相關的線粒體輸入機制，線粒體核糖體蛋白及tRNA合酶等的合成有關[12]。而且NRF1和NRF2還調節著TFAM和轉錄因子B蛋白的轉錄，這兩者都是mtDNA轉錄和復制的主要調控者[12]。雌激素相關受體（ERR-α、ERR-β、ERR-γ）是核受體超家族的成員，在激素信號下促進線粒體生物合成。ERR-α控制著核基因編碼的線粒體相關因子的轉錄，這些因子參與了氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循環和線粒體的融合與分裂[13]。PGC-1α作為轉錄輔助激活因子，控制著線粒體的各類的轉錄因子，包括NRFs和ERRs[13]。在線粒體COX缺陷的小鼠模型中發現過表達PGC-1α能緩解線粒體缺陷及誘導線粒體增殖[14]。此外，在線粒體復合物III和IV缺陷的人類細胞中發現PGC-1α或PGC-1β的表達能明顯提高線粒體呼吸能力[15]。因此，PGC-1α被認為是線粒體生物合成和功能的主要調控者。

研究證實線粒體功能缺陷是許多神經系統疾病的病理基礎[16]。條件性的或突發事件導致的線粒體功能障礙，比如缺氧缺血性腦損傷會使得大腦能量代謝產物ROS大量釋放增加，從而加重神經元損傷[16-17]，此時增加線粒體的數量來代償損傷線粒體的功能成為挽救殘存神經元的關鍵。有研究在短暫性全腦缺血的大鼠中觀察到了線粒體的延伸，這是線粒體生物合成一個重要步驟[18]，而持續30 min的缺血則會引起mtDNA的減少[19]。本研究結果顯示，急性的低O2高CO2刺激增加了線粒體的生物合成，而長期暴露于低O2高CO2環境則引起了線粒體生物合成的減少。行為學實驗發現急性刺激尚未引起實驗大鼠的認知功能，而4周的慢性暴露則引起了大鼠的學習記憶障礙。這可能是在急性應激下，細胞的需氧量增加，氧化磷酸化加速，ROS開始釋放增加。ROS的堆積可以激活線粒體上非特異通透性轉運孔道開放并促使凋亡因子的釋放[20]。受到攻擊的線粒體啟動了一系列的自我保護機制，這其中包括啟動線粒體生物合成來增加線粒體的數量從而代償受損線粒體的功能，以此挽救受威脅的神經元。因此在神經元功能尚能維持的情況下，大鼠的學習記憶尚未受到影響。而在長期的慢性暴露過程中，機體需氧量增加，活性氧自由基不斷產生，神經元細胞大量凋亡及壞死，過多線粒體的生成將有更多的能量消耗，進一步威脅殘余神經元的存活。同時，我們的研究也發現此時大鼠腦內自噬的活性也很高，低氧下的自噬可以促進受損線粒體的降解，并且可以抑制線粒體的生物合成來減少能量消耗[21]。所以我們推測以上各因素的共同影響導致了慢性組大鼠的學習記憶障礙及生物合成的減少。

綜上，急性低O2高CO2環境尚未引起大鼠學習記憶障礙，但卻能增加大鼠海馬區線粒體生物合成水平；而長期暴露低O2高CO2環境則導致大鼠學習記憶能力下降，且出現大鼠海馬區線粒體生物合成水平下降；因此線粒體生物合成水平的下降可能是長期低O2高CO2暴露下大鼠學習記憶障礙的原因之一。