利用數字PCR法檢測肺癌患者血漿游離DNA 中T790M突變

王俊 李瑋 胡穎熹 石立彥 謝宇鋒 喻正源（通訊作者）

（1 蘇州大學附屬第一醫院重癥醫學科 江蘇 蘇州 215000）

（2 蘇州大學附屬第一醫院腫瘤科 江蘇 蘇州 215000）

肺癌位于世界癌癥之首，而大量肺癌患者存在著表皮生長因子受體突變。絡氨酸激酶抑制劑是表皮生長因子受體陽性的晚期非小細胞肺癌患者首選靶向治療藥物。但是患者在服藥后在一定時期內會不可避免的出現耐藥，而在耐藥患者中有50%存在T790M突變[1-2]。阿斯利康最新生產的泰瑞沙能夠有效治療T790M突變的患者[3-4]，因此對T790M突變檢測顯得尤為重要。晚期肺癌患者穿刺活檢存在較大風險，患者也要承受較大痛苦，近年來液態活檢由于采樣方便、創傷小逐漸成為一種重要腫瘤患者基因檢測手段，目前主流檢測方法有二代測序，ARMS法等，而數字PCR最近逐漸成為一種新興的液態活檢方法。本研究對40例經穿刺活檢后對組織進行ARMS法檢測證實存在T790M突變的肺癌患者的血漿游離DNA進行數字PCR法和ARMS法的T790M突變檢測，并對比檢測結果，以探討數字PCR法作為一種新的檢測方法在血漿游離DNA中檢測T790M突變的效果。

1.樣本來源及檢測方法

1.1 收集2015年3月—2018年6月期間在蘇州大學附屬第一醫院病理確診為肺腺癌患者活檢石蠟組織157例，其中活檢組織用ARMS法確認為T790M突變陽性的患者40例。40例樣本中男性18例，女性22例，臨床分期為Ⅲ到Ⅳ期。平均年齡59歲。采集這40例患者的外周血標本。同時采集20例健康志愿人群外周血標本。均采用10ml無創cell free DNA專用采血管（美國streck公司），采血后2h內進行1200g離心10min，吸取上層血漿轉移至2ml離心管，15000g離心12min，吸取上層血漿進行游離DNA提取。

1.2 血漿游離DNA的提取

使用血清/血漿游離DNA分離試劑盒（德國qiagen公司）抽提血漿游離DNA。提取的DNA使用qubit2.0（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行濃度定量。

1.3 血漿游離DNA

T790M突變檢測 采用數字微滴式PCR儀 QX200（美國Bio-Rod公司）及伯樂數字PCR T790M突變檢測試劑盒檢測標本中T790M突變。采用羅氏480熒光定量PCR儀（美國羅氏公司）及人類EGFR基因突變檢測試劑盒（中國廈門艾德公司）檢測標本中T790M突變。結果判讀均參照說明書指示。

2.結果

2.1 40例肺癌患者血漿游離DNA T790M突變結果

40例患者血漿標本中使用數字PCR法檢測到32例T790M突變陽性，8例陰性。ARMS法檢測到27例T790M突變陽性，13例陰性。數字PCR T790M突變檢測敏感度為80%，ARMS法T790M突變檢測敏感度為67.5%。數字PCR法和ARMS法T790M突變檢測一致率為87.5%。見表。

表 數字PCR法和ARMS法檢測40例肺腺癌患者血漿游離DNA T790M突變結果

2.2 2 0 例健康志愿者血漿游離DNA T790M突變結果

20例健康志愿者血漿標本中數字PCR法和ARMS法檢測790M突變結果均為陰性。數字PCR法和ARMS法T790M突變檢測特異度均為100%。

3.討論

絡氨酸激酶抑制劑是表皮生長因子受體陽性的肺腺癌患者的重要靶向藥物，故對表皮生長因子受體突變情況的準確檢測對肺癌患者的診治至關重要。阿斯利康最新研發的泰瑞沙在T790M耐藥突變的肺腺癌進展患者上體現出了非常好的治療效果。我們在40例患者血漿標本中使用數字PCR法檢測到32例T790M突變陽性，8例陰性。ARMS法檢測到27例T790M突變陽性，13例陰性，20例健康志愿者血漿標本使用數字PCR法和ARMS法檢測T790M突變均為陰性。這個結果顯示數字PCR在血漿游離DNA基因檢測上體現出了非常好的敏感性和特異性，未來可以在血漿游離DNA基因檢測上成為一種非常重要的檢測方法進行補充。而受限于血漿游離DNA易降解，以及腫瘤時空異質性等客觀情況，目前和活檢組織的檢測敏感度還存在一定的差別，未來隨著數字PCR檢測方法的改進，以及血漿游離DNA保存和提取的工藝提升，相信數字PCR法的檢測靈敏度還會有進一步的提高。