原發免疫性血小板減少癥患者外周血Th17細胞的檢測及意義

李秀芹 張虎田

（東海縣人民醫院血液科 江蘇 東海 222300）

原發免疫性血小板減少癥（ITP）亦稱特發性血小板減少性紫癜，是臨床常見的出血性疾病，屬于器官特異性自身免疫性疾病。ITP的發病機制未完全明了，傳統觀念認為機體體液免疫異常，B細胞產生大量抗血小板抗體介導血小板在單核吞噬細胞系統被破壞。然而越來越多的研究表明細胞免疫異常亦參與ITP的發病機制[1]。T細胞主要分為CD4+、CD8+T細胞，CD4+/CD8+T細胞平衡對維持機體的免疫穩定具有重要作用。Th17細胞是新發現的以高分泌IL-17為特征的CD4+T細胞亞群。研究表明Th17細胞在實驗性腦脊髓膜炎、變應性膠原病及類風濕性關節炎中發揮重要作用[2,3]。關于Th17細胞在ITP中作用研究甚少。因此本實驗通過檢測ITP患者外周血T細胞亞群、Th17細胞的百分率，初步闡明其在ITP發病機制中的作用。

1.資料和方法

1.1 研究對象

30例ITP患者均為2016年3月—2018年8月來我院血液科就診的住院和門診患者，其中男10例，女20例，中位年齡35歲（12歲～78歲），診斷均符合張之南的《血液病的診斷與療效標準》[4]。30例對照者為來我院體檢的健康者，男10例，女20例，中位年齡36歲（13歲～80歲）。所有ITP患者的血小板計數均＜30×109/L，均數為：（8.05±6.79）×109/L。健康對照者血小板計數在（100～300）×109/L，均數為：（176.43±64.52）×109/L。

1.2 標本采集

所有ITP患者和對照者均空腹外周靜脈采血1ml，肝素抗凝。

1.3 主要試劑和儀器

Anti-CD4-FITC、Anti-CD3-PerCP、Anti-CD8-PE均購自美國BD公司，Anti-IL-17A-Alexa Fluor647（Anti-IL-17A-AF647）購自美國BioLegend公司，無酚紅RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，PMA、BFA購自美國Invitrogen公司，Ionomycin購自美國Sigma公司，固定劑、破膜劑購自AN DER GRUB公司，溶血素購自美國BD公司，1×PBS緩沖液為本實驗室自配，FACS Calibur型流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.4 T細胞亞群檢測

取一流式管加入Anti-CD4-FITC/Anti-CD3-PerCP/Anti-CD8-PE各2μl，再加入外周血100μl，避光孵育20min，加入1ml溶血素，避光溶血5min，1×PBS 2ml洗滌，離心（2000r/min，2min），共2次，棄上清，加200μl PBS，上機檢測。

1.5 Th17細胞的檢測

取一EP管加入新鮮肝素抗凝血100μl，無酚紅RPMI1640培養基860μl混勻，再加入10μl PMA工作液，10μl Ionomycin工作液，20μl BFA工作液，體系中PMA、Ionomycin、BFA終質量濃度分別為50ng/ml、750ng/ml、10μl/ml。在37℃水浴箱中培養3h；將培養后的細胞懸液輕輕混勻取600μl，加入1個流式管中，離心（2000r/min，2min）；棄上清，振蕩混勻，加入Anti-CD4-FITC 2μl，避光孵育15min；加100μl固定液，避光放置15min；加2ml 1×PBS洗滌，離心（2000r/min，2min）；棄上清，振蕩混勻，加100μl破膜劑，避免震蕩，輕輕混勻，避光5min；管中再加入2μl Anti-IL-17A-AF647，輕輕混勻，避光孵育15min；加2ml 1×PBS洗滌一次，離心（1500r/min，5min），棄上清，上機檢測。

1.6 統計學分析

SPSS16.0統計軟件對數據進行分析，數據符合正態分布用均數加減標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05具有統計學意義。

2.結果

2.1 ITP患者外周血T細胞亞群的分析

與健康對照組比較，ITP患者組CD3+T細胞百分率降低，但無統計學意義（P＞0.05）；CD4+T細胞百分率、CD4+/CD8+T細胞比率降低（P＜0.05）；CD8+T細胞百分率升高（P＜0.05）。具體見表。

表 ITP患者外周血T細胞亞群的分析 （%,±s）

表 ITP患者外周血T細胞亞群的分析 （%,±s）

aP＜0.05 ITP組vs對照組。

組別 n CD3 CD4 CD8 CD4+/CD8+ITP 組 30 69.74±9.01 29.00±9.23a 34.18±9.45a 1.06±0.41a對照組 30 73.63±7.01 40.05±5.40 28.12±4.38 1.54±0.43

2.2 ITP患者外周血Th17細胞的百分率

ITP患者組的Th17細胞的百分率：（2.71±1.02）%，對照組Th17細胞的百分率：（2.01±0.48）%。ITP患者組的Th17細胞的百分率較對照組升高（P＜0.05），差異具有統計學意義。見圖1。

圖1 Th17細胞的流式檢測分析

以CD4+T IL-17+界定為Th17細胞，即右上象限為Th17細胞百分率。a為健康對照者，b為ITP患者。

3.討論

ITP是一因血小板免疫性破壞，導致外周血中血小板減少的出血性疾病。其發病機制未完全明了，目前大量研究表明體液、細胞免疫異常均參與ITP的發病過程。T細胞主要分為CD4+和CD8+T細胞，CD4+/CD8+T細胞之間的平衡是維持機體免疫穩定的中心環節。馮建軍等[5]研究發現ITP患者存在CD4+/CD8+T細胞比例失衡，提示T細胞亞群失調參與了ITP的發病過程。本實驗再次證實與對照組相比ITP患者組CD4+T細胞百分率減低，CD8+T細胞百分率升高，CD4+/CD8+T細胞比率降低。ITP患者存在CD4+/CD8+T細胞比例失調，T細胞亞群失衡參與了ITP的發病過程。本實驗測得ITP患者組CD3+T細胞百分率較對照組降低但無統計學差異，與馮建軍等研究報道不一致，其可能的原因有待于進一步研究。

Th17細胞是2005年Park[2]在實驗性自身免疫性腦脊髓炎和膠原蛋白誘導性關節炎典型的自身免疫性動物模型的研究中發現的不同于Th1、Th2細胞的CD4+T細胞亞群。Th17細胞是因特異性分泌IL-17而得名。IL-17具有促炎反應作用。研究表明Th17細胞參與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等[3,6,7]自身免疫性疾病的發病過程。本實驗測得ITP患者組Th17細胞百分率較對照組升高。提示ITP患者體內Th17細胞數量增多，分泌過多IL-17，通過IL-17參與ITP的發生、發展。因此Th17細胞百分率增高可能參與ITP的發病過程。

總之，本研究再次證實了ITP患者CD4+T細胞百分率降低，CD8+T細胞百分率升高，存在CD4+/CD8+T細胞比例失衡，細胞免疫異常參與ITP的發病過程。ITP患者Th17細胞百分率升高，通過對Th17細胞的深入研究有助于進一步明確ITP的發病機制，為臨床治療ITP提供新的靶點。