根據WS/T 505-2017文件對血清梅毒抗體ELISA定性方法性能驗證

曹玉亭 郭長青（通訊作者） 王海永 楊學文

（1 南湖社區衛生服務中心檢驗科 江蘇 南京 210017）

（2 江蘇省中醫院檢驗科 江蘇 南京 210029）

梅毒是一種常見的慢性、系統性性傳播疾病，由梅毒螺旋體引起，可經性接觸、輸血、母嬰垂直等途徑傳播，嚴重危害到患者的正常工作與生活，梅毒臨床上常表現為三期，其進展與癥狀非常復雜，而實驗室診斷結果為臨床醫生診治的重要依據，常用的實驗診斷方法有多種，主要分為定性與定量兩大類，相比定量方法，定性方法有檢測迅速、靈敏度高、應用廣泛、方法學較成熟、成本低等優點。TP-ELISA是以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板，再加入待檢血清以及酶標抗原，形成雙抗原夾心，同時檢測IgG、IgM抗體。我科ISO15189復評審在即，現根據WS/T 505-2017文件，對本科室梅毒抗體定性方法TP-ELISA分析性能進行驗證。

1.材料與方法

1.1 檢測系統

Tecan公司的FREEDOM EVOLYZER-2全自動酶標儀，英科新創（廈門）科技有限公司生產的診斷試劑盒（雙抗原夾心酶聯免疫法），質控品為北京康徹思坦生物技術有限公司生產的梅毒螺旋體抗體定值質控血清和本室留取的陰性混合血清，及相關耗材。

1.2 標本來源

收集江蘇省中醫院2017年已經臨床確診，且經化學發光法檢測確定梅毒抗體A值的患者血清標本，用本院體檢正常血清將該原始血清分別稀釋5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍制成多個低抗體滴度梯度標本。

1.3 操作人員

經過驗證方案培訓，并經科主任崗位授權的技術工作人員。

1.4 方法

（1）請廠家工程師對儀器進行校驗，使儀器各項功能使用均正常。

（2）臨界值的驗證

酶標儀上每標本重復測定40次并記錄A值，以廠家提供的CUTOFF值判斷陰陽性，取陽性結果數與陰性結果數大致相當的標本濃度為C50，再以原始血清標本稀釋制成C50-20%與C50+20%兩份標本；以上兩份標本各在酶標儀上重復測定100次，分別統計陽性與陰性結果數，如表2。

（3）陰性與陽性符合率的驗證

對低于C50-20%的標本與高于C50+20%的標本分別用酶標儀和化學發光儀測定，以前者為測得結果，后者為最終結果，兩者結果比較，計算陰性與陽性符合率。

主要是依據WS/T 505-2017文件中的相關標準。

1）臨界值：若C50±20%包括C5～C95，則符合要求。

2）精密度：若不精密度在文件規定的允許范圍內，則符合要求。

3）陰、陽性符合率：測得結果與最終結果一致程度。

2.結果判定

對各梯度濃度標本重復測定后，結果在稀釋倍數為35和40時，陽性結果數分別為29和12，根據WS/T 505-2017文件，C50對應的稀釋倍數應在35和40之間，見表1，用原始血清分別作36倍、37倍、38倍及39倍稀釋，并在酶標儀上測定此四濃度標本梅毒抗體吸光度A值，最終確定稀釋38倍標本吸光度為0.172對應的標本抗體濃度為C50，計算得C50-20%和C50+20%對應的吸光度分別為0.136和0.204。C50-20%濃度（0.136）100次重復測定結果陽性百分率為4%，小于5%；C50+20%濃度（0.204）100次重復測定結果陽性百分率為98%，大于95%，如表2。根據文件要求，說明廠家提供的檢測項目臨界值可靠。

表1 C50值的確定

表2 陰/陽性百分率

3.討論

正常人體感染梅毒螺旋體后4～10周左右，血清中可產生抗梅毒螺旋體抗體，定性測定抗梅毒抗體主要用于快速篩檢與排除梅毒患者。臨床實驗室使用的定性試劑，廠家都提供了檢測臨界值、靈敏度、精密度以及陰陽特異性等參數，但這些參數均是廠家在最佳實驗條件下獲得給定的，臨床實驗室由于實驗條件與環境的差異，需按各自的檢測系統進行性能評價并確定自己的性能參數。