小鼠肺癌正位模型的建立

周愷驊，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

據(jù)世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心(IARC)報告，肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。美國癌癥協(xié)會(American Cancer Society)統(tǒng)計，2017年全美新增的609 640例癌癥死亡病例中，肺癌分別以26%和25%占據(jù)男、女癌癥死亡病例的首位[1-2]。為了深入地研究肺癌，動物模型是所有研究的基礎(chǔ)。現(xiàn)有的肺癌模型主要分為2種，一種是通過誘導(dǎo)上皮轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)，利用化學(xué)致癌物或基因工程改變致癌基因或抑癌基因的表達(dá)[3]，另一種是利用肺癌細(xì)胞株或患者腫瘤細(xì)胞進(jìn)行異位或正位遞送。前者易于肺癌遺傳學(xué)上的研究及靶向藥物的研發(fā)，但是成瘤時間較長、建模系統(tǒng)相對復(fù)雜及成本較高等問題限制了其應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的是利用癌細(xì)胞株進(jìn)行皮下異位移植，但也有學(xué)者比較了小鼠正位肺癌模型和皮下模型，認(rèn)為正位模型雖然操作復(fù)雜，但其轉(zhuǎn)移率和腫瘤生物學(xué)特征更符合臨床實際情況[4]。已有研究利用Lewis細(xì)胞株建立小鼠正位肺癌模型[5-7]，這些研究較多地選擇了開放性的方式，對小鼠胸部皮膚切開后進(jìn)行肺部正位注射來構(gòu)建肺癌模型。這種方式對操作者的要求較高，耗時較多，難以滿足量大的動物實驗研究。本文基于前者的研究，探索了一種非開放性的建模方式，利用穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系進(jìn)行肺癌正位模型的建立。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

Lewis肺癌(lewis lung carcinoma，LLC)細(xì)胞株屬鼠源性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院。

1.1.2 試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、嘌呤霉素(Gibco，美國)，青霉素-鏈霉素溶液(碧云天，中國)，Matrigel基質(zhì)膠(BD，美國)。

1.1.3 實驗動物

C57BL/6小鼠購自上海斯萊克動物中心，雄性，5～6周齡，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗室，獨立送風(fēng)柜中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的LLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

構(gòu)建plvx-EF1α-luc2-gfp-puro載體質(zhì)粒包裝慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)LLC細(xì)胞，使其在表達(dá)熒光素酶的同時又具有嘌呤霉素抗性及綠色熒光蛋白(GFP)雙篩選標(biāo)記。1)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。取生長狀態(tài)良好的LLC細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取2×105個細(xì)胞培養(yǎng)24 h，更換為不含抗生素的培養(yǎng)基，加入載體質(zhì)粒plvx-EF1α-luc2-gfp-puro包裝的慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。2)嘌呤霉素篩選。對感染后的細(xì)胞進(jìn)行換液，培養(yǎng)24 h后更換為含有2 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基，同時以未經(jīng)過感染的LLC細(xì)胞作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。3)流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽性的LLC細(xì)胞。對經(jīng)過嘌呤霉素篩選的細(xì)胞進(jìn)行流式分選，篩選出單個GFP陽性細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)于20% FBS的培養(yǎng)基，第5天在熒光顯微鏡下標(biāo)記出生長狀態(tài)較好的單克隆群，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對細(xì)胞株鑒定后凍存保種。

1.2.2 小鼠正位肺癌模型的構(gòu)建

將含有表達(dá)熒光素酶的LCC細(xì)胞(5×104個)細(xì)胞懸液與Matrigel基質(zhì)膠等體積混勻，抽吸入事先預(yù)冷好的胰島素注射器。使用異氟烷將小鼠麻醉，待小鼠呼吸平穩(wěn)，呼吸頻率降低后，捏緊小鼠胸部皮膚使其暴露整個胸部輪廓，對其皮膚進(jìn)行消毒，在小鼠左側(cè)肋弓下緣1～1.5 cm與左鎖骨中線交叉處注射，進(jìn)針深度3～5 mm，角度以垂直為佳，注射細(xì)胞懸液25 μL，注射完后停頓5～10 s。

1.2.3 小鼠活體成像操作

小鼠于腫瘤細(xì)胞注入后第6、16、26、36和46天進(jìn)行活體成像。首先給予小鼠腹腔注射蟲螢光素酶底物，濃度為15 mg·mL-1，劑量為150 mg·kg-1，底物作用3 min后，予以異氟烷吸入麻醉，然后再放入主機(jī)箱內(nèi)，共曝光10 min，每隔30 s進(jìn)行圖像拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的LLC細(xì)胞株的建立

通過基因工程改造的細(xì)胞株往往不及野生型穩(wěn)定，而異種移植入小鼠體內(nèi)后熒光素酶基因容易丟失，熒光值的大小無法準(zhǔn)確地代表活體小鼠內(nèi)腫瘤的大小。為得到表達(dá)更穩(wěn)定的細(xì)胞株，本研究自主構(gòu)建載體質(zhì)粒plvx-EF1α-luc2-gfp-puro包裝慢病毒，成功轉(zhuǎn)導(dǎo)LLC細(xì)胞后，可使其在表達(dá)熒光素酶的同時又具備嘌呤霉素抗性和GFP這2個雙篩選標(biāo)記。LLC細(xì)胞在病毒感染24 h后用嘌呤霉素進(jìn)行首輪篩選，此時GFP陽性的細(xì)胞約為90%；再用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行第2輪篩選，分選出單個GFP陽性細(xì)胞。在分選后第5天和第10天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，其中有10個單克隆群細(xì)胞活力較好(圖1)。對分選出的單克隆群進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞術(shù)對活細(xì)胞中GFP的陽性率進(jìn)行檢測，陽性率均可達(dá)到95%以上(圖2)。

圖1 LCC細(xì)胞的生長形態(tài)

圖2 LLC活細(xì)胞中GFP的陽性率(%)

A,細(xì)胞活體成像；B,熒光顯微鏡觀察；C，Western blot檢測LLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中GFP和luciferase蛋白水平的表達(dá)情況圖3 表達(dá)熒光素酶的LLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定

取活力較好的1株進(jìn)行動物建模，利用細(xì)胞活體成像、熒光顯微鏡以及Western blot對細(xì)胞進(jìn)行鑒定(圖3)。結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的LLC細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.2 小鼠正位肺癌模型的建立

利用LLC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，以C57BL/6小鼠構(gòu)建正位肺癌模型。整個實驗的觀察周期為60 d，期間每隔1天記錄小鼠體重，觀察小鼠精神狀態(tài)、行動力。取部分小鼠每10 d進(jìn)行1次活體成像，記錄腫瘤變化情況。在腫瘤注入后的第4周，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)體重大幅下降、毛色變差、行動力減弱等惡病質(zhì)變，小鼠呼吸頻率加快、弓背狀呼吸等腫瘤浸潤肺部的體征十分明顯，個別小鼠甚至出現(xiàn)腫瘤侵襲脊髓后偏癱的現(xiàn)象(圖4)。小鼠解剖后，可見肺部腫瘤的形成，部分肺葉有出血性病變，小鼠脾臟出現(xiàn)出血性壞死。

取病變肺葉進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，正常的肺泡結(jié)構(gòu)已經(jīng)消失，可見大量增殖的異型性腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞大小形狀不一、排列不規(guī)則、細(xì)胞分化差、核大深染、核質(zhì)比增大、分裂相多見(圖5)。

活體成像結(jié)果如圖6所示。隨著腫瘤變大，光子量不斷增加，在最后一次成像中由于光子量過強(qiáng)而導(dǎo)致無法成像。小鼠的體重變化和生存率如圖7所示，與活體成像結(jié)果相符合。

3 討論

小鼠肺癌模型包括了自發(fā)性腫瘤模型和移植性腫瘤模型。自發(fā)性腫瘤模型可通過化學(xué)致癌物或基因工程來實現(xiàn)，這類模型由于成瘤時間較長、建模系統(tǒng)相對復(fù)雜，以及成本較高等問題限制了其應(yīng)用[8]。移植性腫瘤模型因成瘤率穩(wěn)定、所需成瘤時間較短等特點，在實際科研中更為常用。移植性小鼠肺癌模型主要分為正位移植模型及異位移植模型，正位移植又包括了支氣管內(nèi)注射和肺內(nèi)注射2種方法。Sato等[9]使用氣管內(nèi)注射構(gòu)建正位移植模型，但該方法操作復(fù)雜、成瘤及瘤體大小、數(shù)目均不穩(wěn)定。因此，腫瘤的正位移植動物模型是目前較為理想可靠的腫瘤模型。

A，腫瘤侵襲小鼠肺組織和脊髓受腫瘤浸潤后的表現(xiàn)；B,小鼠肺部和脾臟大體病變圖4 C57BL/6小鼠正位肺癌模型構(gòu)建

圖5 小鼠肺組織的病理學(xué)觀察

圖6 小鼠活體的成像情況

圖7 小鼠存活率和平均體重

Lewis細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用于肺癌正位模型的建立，最初由Bertram等在C57BL/6小鼠身上獲取，其成瘤性強(qiáng)，在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移性較弱[10]。由于該細(xì)胞株具有較強(qiáng)的成瘤性，有學(xué)者對其建模所需的細(xì)胞量進(jìn)行了探討。Liu等[11]用接種細(xì)胞總數(shù)104、105和106進(jìn)行造模，成瘤率分別為83.3%、100%和100%。低劑量組由于接種時細(xì)胞有滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)未達(dá)104而有部分小鼠造模不成功，高劑量組在第3天即可長出腫瘤，第9天全部小鼠成瘤。高劑量組所面臨的問題是大量細(xì)胞可以誘導(dǎo)快速和廣泛的炎癥反應(yīng)，并且這些細(xì)胞可以壓倒并逃避針對原發(fā)性腫瘤的正常免疫應(yīng)答，所以大劑量的細(xì)胞可能并不適合后期的實驗需求。Weiss等[7]在構(gòu)造早期肺癌模型中僅以1 000個細(xì)胞就達(dá)到了100%的成瘤率。綜合以上研究，本研究以5×104作為注射量，注射后小鼠在第6天可以檢測到腫瘤，第16天成像時成瘤率可達(dá)100%，第5周開始出現(xiàn)惡病質(zhì)，中位生存期為46 d。

本研究中所用到的活體生物熒光成像技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項分子、基因表達(dá)的分析檢測系統(tǒng)，主要由敏感的CCD設(shè)備及其分析軟件和作為報告子的熒光素酶以及熒光素組成。該技術(shù)是在小型哺乳動物體內(nèi)利用報告基因-熒光素酶基因表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗 ATP 發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽饽茚尫牛缓笤隗w外利用敏感的 CCD 設(shè)備形成圖像。該方法具有很好的靈敏度，可以準(zhǔn)確的檢測到腫瘤的大小，同時也要求LLC細(xì)胞系可以穩(wěn)定的表達(dá)熒光素酶。在篩選細(xì)胞時，本研究設(shè)計了GFP和嘌呤霉素抗性2個篩選標(biāo)記，經(jīng)過2輪篩選從而獲得表達(dá)更穩(wěn)定的細(xì)胞系。也有學(xué)者利用GFP進(jìn)行成像，建立穩(wěn)定表達(dá)GFP的LLC細(xì)胞，對C57BL/6進(jìn)行肺部注射，用熒光護(hù)目鏡和激光二極管泵浦(LDP)470 nm的藍(lán)光手電筒觀察成瘤情況[12-13]。應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)，在小鼠皮下最少可以檢測到經(jīng)生物發(fā)光標(biāo)記的3個T細(xì)胞[14]。與利用激發(fā)光與反射光的熒光成像相比，酶和底物的特異性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過熒光物質(zhì)發(fā)光的特異性，可以形成極高的信噪比，所以生物發(fā)光的靈敏度要高出熒光的靈敏度大約一萬倍，并且有更高的特異性。

在以往的研究中，利用LLC細(xì)胞系建立小鼠正位肺癌模型往往以開放性手術(shù)的方式對小鼠進(jìn)行胸部皮膚切開，該方法可以準(zhǔn)確地找到肺葉所在位置，防止細(xì)胞外漏于胸腔。在前期實驗中，本研究嘗試用該方法進(jìn)行造模。該方法要求操作者手法嫻熟，但也有部分小鼠因為皮膚切開后體溫降低，導(dǎo)致后期麻醉蘇醒時間過長而死亡，并且由于操作過程復(fù)雜、時間過長，無法滿足后期大規(guī)模動物實驗的要求。本研究探索了非開創(chuàng)性的造模方式，成功建立了小鼠正位肺癌模型，節(jié)約了造模時間，對大規(guī)模的肺癌動物研究具有重要意義。