紅豆杉屬植物中紫杉烷類物質(zhì)含量比較

姜艷，沈晨佳，周丹英，余琪*

(1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 2.杭州師范大學(xué)，浙江 杭州 310018)

紅豆杉又名紫杉、赤柏松，為國家一級(jí)保護(hù)樹種。在我國，紅豆杉主要有4種、1變種，分別為中國紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉。此外，還有20世紀(jì)末引種我國的雜交品種曼地亞紅豆杉，其母本是東北紅豆杉，父本是歐洲紅豆杉[1]。

近年來，紅豆杉因植株中含有高效抗癌成分紫杉醇等活性成分而倍受關(guān)注[2]。臨床研究表明，紅豆杉在抗腫瘤方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[3]。目前，從紅豆杉屬植物中已分離得到400多種紫杉烷類化合物，并且不斷有新的化合物被分離和鑒定[4-5]，大多數(shù)該類成分均顯示出較強(qiáng)的抗癌活性[6-7]。除紫杉醇外，10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿和7-表-10-脫乙酰基紫杉醇(10-DAT)等也都是紫杉烷化合物，可作為紫杉烷類藥物半合成和修飾的起始原料，在抗癌藥物中得到了一定的應(yīng)用。本文建立基于高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)紅豆杉中上述5種紫杉烷類成分含量的方法，并對(duì)5種紅豆杉(西藏紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉)枝葉中的紫杉烷類成分含量進(jìn)行對(duì)比研究，旨在為紅豆杉種源選育及野生資源保護(hù)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

西藏紅豆杉(TaxuswallichianaZucc.)采自西藏墨脫縣，云南紅豆杉(TaxusyunnanensisCheng et L.K.Fu)采自云南德欽縣，南方紅豆杉[Taxuschinensis(Pilger) Rehd.var.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L.K.Fu)采自浙江德清縣，東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb.et Zucc.)采自吉林撫松縣，曼地亞紅豆杉(Taxus×media)采自安徽和縣。各樣品采摘時(shí)間均為夏季，經(jīng)浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室馮尚國實(shí)驗(yàn)師鑒定。

標(biāo)準(zhǔn)品：紫杉醇、10-DAB、10-DAT，購于阿拉丁，批號(hào)分別為1516034、1623007、LEAOP17；巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿，購于四川成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)分別為16090210、17022201。各標(biāo)準(zhǔn)品含量均在98%以上。

甲醇、乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

Aglient HP1200 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)。

1.2 色譜條件

1.2.1 10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿

色譜柱：迪馬C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；理論塔板數(shù)按標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算，不低于8 000；檢測(cè)波長：227 nm；流速：0.8 mL·min-1。流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，水。采用梯度洗脫，分時(shí)流動(dòng)相體積比(A∶B)：0～10 min，20∶80；10～30 min，33∶67；30～40 min，45∶55；40～60 min，50∶50；60～61 min，43∶57；61～75 min，43∶57。

1.2.2 紫杉醇

色譜柱：迪馬C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；理論塔板數(shù)按標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算，不低于8 000；檢測(cè)波長：227 nm；流速：0.6 mL·min-1。流動(dòng)相A，甲醇；流動(dòng)相B，乙腈；流動(dòng)相C，水。流動(dòng)相體積比A∶B∶C為0～30 min 21∶42∶37。

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

分別稱取10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇，制備成濃度分別為21.26、9.00、13.40、28.50、21.64 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 供試樣品溶液

取供試樣品粉末(過3號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz，40 ℃以下)3次(每次加液量分別為50、30、20 mL)，每次30 min，過濾，合并濾液，減壓蒸干，殘?jiān)?5 mL水-二氯甲烷(體積比1∶2)溶液分次溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取二氯甲烷，水層加二氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，40 ℃以下減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.4 檢測(cè)方法學(xué)考查

1.4.1 被測(cè)成分的線性關(guān)系和線性范圍

精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液2～20 μL，按1.2節(jié)色譜條件測(cè)定峰面積，分別以峰面積為因變量(y)，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為自變量(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。

1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，考查測(cè)定方法的精密度。

1.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，室溫下放置，分別在0、1、4、6、12、24 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定，檢測(cè)樣品穩(wěn)定性。

1.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批紅豆杉樣品6份，依前述實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇含量，檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.4.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的紅豆杉樣品，分別添加10-DAB、10-DAT、巴卡亭Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，同前述條件，進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法檢測(cè)性能

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖

5種紫杉烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖1所示?？梢钥闯?，本文方法下各供試紫杉烷類化合物出峰良好，適用于樣品檢測(cè)。

2.1.2 被測(cè)成分的線性關(guān)系和線性范圍

如表1所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，以進(jìn)樣量10 μL計(jì)算，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉寧堿、紫杉醇分別在4.25～25.51、5.36～16.08、5.40～14.40、11.40～34.20、4.33～25.97 μg·mL-1內(nèi)線性良好，決定系數(shù)(R2)均在0.999以上。

表1 被測(cè)成分線性關(guān)系和線性范圍

1，10-DAB；2，10-DAT；3，巴卡亭Ⅲ；4，三尖杉寧堿；5，紫杉醇。a、c，標(biāo)準(zhǔn)品；b、d，樣品圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖

2.1.3 檢測(cè)方法的精密度

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：10-DAB為0.2%，巴卡亭Ⅲ為0.5%，10-DAT為0.6%，三尖杉寧堿為2.3%，紫杉醇為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：10-DAB為1.4%，巴卡亭Ⅲ為0.3%，10-DAT為0.4%，三尖杉寧堿為0.7%，紫杉醇為1.4%，表明儀器精密度良好，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫下比較穩(wěn)定。

2.1.5 檢測(cè)方法的重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各成分含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：10-DAB為4.4%，巴卡亭Ⅲ為3.0%，10-DAT為1.8%，三尖杉寧堿為3.7%，紫杉醇為1.3%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.1.6 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-DAB、巴卡亭Ⅲ、10-DAT、三尖杉寧堿、紫杉醇的加標(biāo)回收率分別為98.9%、93.3%、96.2%、91.4%、99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.0%、1.4%、2.1%、2.4%、0.9%。

綜合上述各項(xiàng)指標(biāo)可知，本文方法符合相關(guān)檢測(cè)要求，可用于檢測(cè)紅豆杉中5種紫杉烷類化合物的含量。

2.2 紅豆杉中紫杉烷類化合物含量對(duì)比

5種紅豆杉屬植物枝葉中紫杉烷類成分的含量見表2。不同種紅豆杉中紫杉烷類化合物含量有較大差異。紫杉醇含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之，且二者的含量遠(yuǎn)高于其他品種，是含量最低的西藏紅豆杉的10余倍。10-DAB含量曼地亞紅豆杉最低，不至其他品種的一半，其他品種含量相近。巴卡亭Ⅲ含量差異較大，以云南紅豆杉含量最高，東北紅豆杉略低，二者的含量遠(yuǎn)高于其他品種。三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之，其他品種含量較低。10-DAT含量普遍較低，最高的為東北紅豆杉，最低的為西藏紅豆杉。5種紫杉烷類化合物總含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉、云南紅豆杉和南方紅豆杉含量相近，西藏紅豆杉最低。

表2 不同品種紅豆杉枝葉中紫杉烷類

綜合各成分來看，東北紅豆杉最具開發(fā)利用價(jià)值，曼地亞紅豆杉作為我國20世紀(jì)末引種的雜交品種，其紫杉醇含量相對(duì)較高，也具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

3 小結(jié)

本文建立起5種紫杉烷類化合物的含量檢測(cè)方法，并對(duì)西藏紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉中5種紫杉烷類化合物含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，紫杉醇和三尖杉寧堿含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉次之；10-DAB含量以曼地亞紅豆杉最低，不到其他品種的一半；巴卡亭Ⅲ含量以云南紅豆杉最高，東北紅豆杉略低；10-DAT含量普遍較低。5種紫杉烷類化合物總含量以東北紅豆杉最高，曼地亞紅豆杉、云南紅豆杉和南方紅豆杉含量相近，西藏紅豆杉最低。綜合來看，東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉較具開發(fā)利用價(jià)值。