枸杞多糖提取工藝優化及不同產地枸杞質量比較

彭 浩， 秦宏偉， 程有君， 劉正華， 李彥連， 宋文路

(1.濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜 273155； 2.山東博康中藥飲片有限公司，山東青州 262500)

枸杞果實枸杞子為我國傳統的寶貴中藥材，具有補腎養肝、潤肺明目、益精、補血等功效[1]。《中華人民共和國藥典》2015版[2](以下簡稱《藥典》)中枸杞子項下規定水分不得超過13%，總灰分不得超過5%，浸出物不得少于55%，以此作為評價枸杞子藥材質量的標準。同時，枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強免疫、保護視網膜、保護生殖系統、治療骨質疏松等作用[3-6]，為《藥典》規定檢測的主要藥用活性成分，它的含量差異亦體現了枸杞品質的差異。近年來枸杞種植面積不斷擴大，產區已由道地主產區寧夏擴大到河北、內蒙古、甘肅、陜西、山西、新疆等省(自治區)[7]。枸杞原料的產地來源與產品的品質密切相關，不同產地的枸杞品質存在不同程度的差異，低溫、高海拔、長日照有益于枸杞中主要活性成分的積累[8]。枸杞多糖提取的常用方法是熱水浸提法，但熱水浸提法提取時間長、耗能多。超聲波輔助提取法因超聲波產生的強烈振動、空化效應、攪拌作用等可以加速植物有效成分進入溶劑，提高提取率，縮短提取時間，簡化操作步驟，在天然產物提取中顯示出了巨大優勢[9-11]。本試驗選用超聲波輔助法提取枸杞多糖，并通過正交試驗進行優化，以期為該成分的開發利用提供依據。同時，以寧夏和河北栽培的枸杞為材料，對它們的水分、總灰分、浸出物及多糖提取率進行測定分析與比較，以此作為中藥選材的依據。

1 材料

試驗儀器為101A-1型電熱鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠)、SX-4-10型箱式電阻爐(北京永光明醫療儀器總廠)、萬用電爐(一聯北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)、DRHH-54型數顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司)、BF-Ⅲ型薄層電動涂鋪器(天津市思利達科技有限公司)、ZF-6型(三用紫外儀上海市金鵬分析儀器有限公司)、L6S型紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)、KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。試驗用枸杞子分別產自寧夏和河北，并經過濟寧學院生命科學與工程系李彥連副教授鑒定為茄科枸杞屬植物枸杞(Lyciumbarbarum)的果實——枸杞子，低溫干燥避光保存；D-無水葡萄糖(含量為99.5%)和枸杞子對照藥材(均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為1108—2025、121072—201410)，其他試劑均為分析純(AR)。本試驗于2017年6月在山東博康中藥飲片有限公司及濟寧學院生命科學與工程系進行。

2 方法與結果

2.1 LBP提取工藝流程

稱取干燥河北枸杞子粗粉0.5 g加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h，過濾，80%乙醇分次洗滌濾渣。濾渣中加入蒸餾水，超聲波處理，回流。過濾并冷卻后，蒸餾水定容至250 mL。

2.2 標準曲線的制備

多糖測定采用改進的苯酚-硫酸法[12]。使用葡萄糖標準品精確配制濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。依次量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液，用蒸餾水定容至 2.0 mL。各加入1 mL 5%的苯酚、5 mL濃H2SO4，40 ℃水浴中保溫15 min，冷卻至室溫，于490 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度作為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2.3 LBP提取率的測定

根據葡萄糖標準曲線制作方法測定容后的枸杞多糖溶液吸光度，根據式(1)計算枸杞多糖提取率。

枸杞多糖提取率=CVD/m×100%。

(1)

式中：C為根據標準曲線求得的多糖濃度，g/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；D為枸杞多糖的稀釋倍數；m為枸杞原料質量，g。

2.4 單因素試驗設計

影響枸杞多糖提取率的因素比較多，如料液比、提取溫度和時間、提取次數、pH值等。以超聲波作為多糖樣品的輔助提取方法，單因素試驗設計如下：

2.4.1 料液比對LBP提取率的影響 固定超聲時間為 30 min，加熱回流提取時間為60 min，測定料液比分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60(g ∶mL)時的多糖提取率，結果如圖1所示。

由圖1可知，多糖的提取率隨著料液比的增加而逐漸增大。這是由于溶劑的增加有利于多糖的擴散傳質，從而增加多糖的提取率[13]。當料液比達1 g ∶40 mL后，隨著水量的增加，提取率增加不明顯，而且當料液比超過1 g ∶50 mL后，過多的溶劑則會消耗大量超聲波輻射能量，影響多糖的析出，因而提取率呈現下降的趨勢。所以提取料液比選取在 1 g ∶40 mL 左右。

2.4.2 回流時間對LBP提取率的影響 固定料液比 1 g ∶40 mL，超聲時間為30 min，測定加熱回流提取時間分別為30、60、90、120、150、180 min時的多糖提取率，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著回流時間的增加，多糖的提取率也在增加，且在120 min內增加顯著，之后趨于平緩。本著節能原則，回流提取時間在120 min左右為宜。

2.4.3 超聲時間對LBP提取率的影響 固定料液比 1 g ∶40 mL，加熱回流提取時間為120 min，測定超聲時間分別為30、45、60、75、90、105 min時的多糖提取率，結果如圖3所示。

由圖3可知，在超聲時間為30～60 min之間時，多糖提取率隨超聲時間的增加而上升，但是當超聲時間超過60min后提取率緩慢下降。超聲波時間短使多糖不能充分溶解，但超聲波處理時間過長其強剪切作用使大分子多糖斷裂，造成多糖的損失[14]。所以超聲時間應選取在60 min左右。

2.5 正交試驗設計

根據單因素試驗的結果，選取料液比、超聲時間、回流時間3個因素的各3個適宜水平(表1)，按L9(34)進行正交試驗[12]，優化提取工藝，確定最佳提取工藝條件，結果如表2所示。

表1 正交試驗因素與水平

表2 L9(34)正交試驗結果

2.6 LBP提取率方差分析

為進一步確定超聲波輔助法提取LBP的最佳工藝條件，評估和判斷試驗誤差和條件對試驗結果的影響，利用SPSS 19.0軟件進行方差分析，結果如表3所示。由表2和表3可知，料液比、回流時間、超聲時間都會影響LBP提取率，且均達到了顯著水平(P<0.05)。由于RC>RA>RB，所以超聲時間對提取率影響最大。由k值可知最優水平為A3B2C3，即料液比1 g ∶50 mL、回流時間120 min、超聲時間70 min。

表3 方差分析

注：“**”表示差異顯著(P<0.05)。

2.7 驗證試驗

對通過正交試驗得出的最佳工藝條件進行驗證試驗，3次平行試驗的提取率平均值為(9.06±0.23)%，接近預期值，且顯著高于其他條件下的LBP提取率。

2.8 不同產地枸杞的質量評價

選用水分、總灰分、浸出物和多糖提取率作為評價指標，對河北枸杞子和寧夏枸杞子進行質量評價。將干燥枸杞子粉碎，過二號篩[24目，篩孔內徑為(850±29) μm]備用。

2.8.1 水分測定法 參照《藥典》中的烘干法進行測定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份2 g，計算供試樣品含水量(%)，結果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的水分均符合《藥典》中不得超過13.0%的要求。

2.8.2 總灰分測定 參照《藥典》中的總灰分測定方法進行測定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份2 g，計算供試品中總灰分的含量(%)，結果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的總灰分測定均低于《藥典》5.0%的要求。

表4 不同產地枸杞中水分、總灰分、浸出物及多糖提取率

2.8.3 浸出物測定 參照《藥典》中的熱浸法進行浸出物測定，精確稱取2種枸杞子粉末各3份，每份4 g，計算浸出物的含量(%)，結果如表4所示。由表4可知，2種枸杞子的浸出物含量均符合《藥典》中不得少于55.0%的規定標準。

2.8.4 糖類的定性鑒別 干燥的枸杞子粉末0.5 g，加水溶解至50 mL后將其置于加熱套中加熱回流15 min，冷卻過濾后濾液置于梨形分液漏斗中加入15 mL乙酸乙酯萃取，將萃取的乙酸乙酯液轉移至蒸發皿中沸水浴濃縮至1 mL，得到供試品溶液。采用同樣的方法制備枸杞對照藥材溶液，作為對照。按照薄層色譜法試驗，各吸取5 μL供試品溶液和對照溶液分別點至同一硅膠G薄層板，將其放置在展缸中，加入展開劑(比例為3 ∶2 ∶1的乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸)，展開，至8 cm后小心取出晾干，將硅膠薄板置于紫外光燈(365 nm)下檢視。由圖4可知，2種枸杞子中均含有多糖成分。

2.8.5 枸杞多糖提取率測定 按照“2.6”節優化出的最佳工藝條件分別提取2種枸杞多糖，并進行提取率測定。由表4可知，寧夏枸杞多糖提取率明顯高于河北枸杞。

2.8.6 2種枸杞多糖的體外抗氧化性分析與比較

2.8.6.1 2種枸杞多糖的總抗氧化能力比較 采用FRAP法[15-16]，分別取1 mL不同質量濃度的2種枸杞多糖水溶液進行測定，空白組以水代替樣品，對照組則為同等質量濃度的維生素C溶液。以1.0 mmol/L FeSO4溶液為標準物繪制標準曲線，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需FeSO4的濃度(μmol/L)表示，定義為FRAP值，結果如圖5所示。

由圖5可知，寧夏枸杞和河北枸杞多糖總抗氧化能力隨著質量濃度的增加而逐漸增強，當質量濃度為25 mg/mL時，其總抗氧化能力分別達到99.39、86.25 μmol/L，說明2種枸杞多糖均具有一定的總抗氧化能力。但與同質量濃度的維生素C相比，枸杞多糖的FRAP值較小，說明總抗氧化能力略小。此外，在相同質量濃度下，寧夏枸杞總抗氧化能力顯著高于河北枸杞。

2.8.6.2 2種枸杞多糖對DPPH自由基的清除能力比較 參考Atoui等的測定方法[16-17]，分別取1 mL不同質量濃度的2種枸杞多糖的水溶液進行試驗，空白組以水代替樣品，對照組則為同等質量濃度的維生素C。DPPH自由基清除率按式(2)計算，結果如圖6所示。

(2)

式中：D1為樣品組的吸光度，D0為空白組的吸光度。

由圖6可知，質量濃度在0～25 mg/mL范圍內，2種枸杞多糖對DPPH自由基的清除率隨樣品質量濃度升高而增大。當質量濃度為25 mg/mL時，寧夏枸杞和河北枸杞多糖對DPPH自由基清除率達到最大值，分別為60.98%和56.39%，說明2種枸杞均具有一定的DPPH自由基清除能力。與同質量濃度的維生素C標準品相比，2種枸杞多糖對DPPH自由基的清除率略小，但在相同質量濃度下，寧夏枸杞多糖對DPPH自由基清除能力明顯高于河北枸杞多糖。

2.8.6.3 2種枸杞多糖對羥自由基的清除能力比較 采用 2- 脫氧核糖法[16，18]，分別取500 μL不同質量濃度的2種枸杞多糖的水溶液進行試驗，空白組以水代替樣品，對照組則為同等質量濃度的維生素C。DPPH自由基清除率按式(3)計算，結果如圖7所示。

(3)

式中：D1為樣品組的吸光度，D0為空白組的吸光度。

由圖7可知，質量濃度在0～25 mg/mL范圍內，2種枸杞多糖對羥自由基的清除率隨樣品質量濃度升高而增大。在25 mg/mL時，寧夏枸杞和河北枸杞多糖對羥自由基清除率達到最大值，分別為82.02%和81.96%。2種枸杞多糖羥自由基清除能力差異不明顯，但均略大于同質量濃度下維生素C的羥自由基清除率，說明2種枸杞多糖具有較強的羥自由基清除能力。

3 結論

通過單因素試驗和SPSS 19.0軟件對LBP提取條件進行了正交試驗優化，得到優化后的工藝條件為料液比 1 g ∶50 mL，回流時間120 min、超聲時間70 min。各因素對LBP提取率的影響順序為超聲時間>料液比>回流時間，驗證試驗的結果與預測值接近，表明通過正交試驗所得的優化條件穩定、可靠。同時，比較了不同產地枸杞水分、總灰分、浸出物和多糖提取率。從測定結果可以看出，寧夏枸杞和河北枸杞均符合藥典標準，但二者多糖提取率差別較大，其中，采用優化工藝提取并測定的寧夏枸杞多糖提取率更高，達21.39%，且寧夏枸杞多糖的抗氧化活性優于河北多糖。近年來枸杞配方的中藥產品逐年增加，大多數取其補益和增強免疫功能的作用，產品的功效與枸杞多糖抗氧化活性有密切的關系，本試驗的結果能為枸杞多糖的開發利用、有關廠家選擇用藥及適當調整枸杞用藥劑量提供可參考的依據。