滇重樓種子形態及發芽特性的產地差異研究

朱艷霞， 黃燕芬， 柯 芳

(廣西壯族自治區藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530023)

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)的干燥根莖是我國傳統名貴中藥材重樓的基源之一，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效[1]。近年來，由于人們掠奪式采挖，其野生資源瀕臨滅絕，已被列為國家二級瀕危藥用植物和云南省稀缺瀕危天然藥物[2-4]。滇重樓種子成熟時胚發育不完整[5]，外種皮和種子中存在種子萌發抑制物[6-8]，內源脫落酸含量高[9]等是造成其種子休眠的主要原因，去除種皮[10]、變溫層積[11]、超聲波處理[12]、濕沙層積協同赤霉素處理[13]、低溫層積協同紅外光照射[14]等處理均能解除種子休眠狀態，發芽適宜的溫度是18～20 ℃，適宜的光照是750～1 500 lx的弱光，適宜的發芽床是沙[15-17]。隨著滇重樓種子萌發機制的深入研究，野生變家種技術也成功突破，目前云南、四川、貴州、廣西、湖南等地均有成功引種栽培滇重樓的報道。隨著滇重樓栽培區域的不斷擴大，引進地生態環境與原生地環境差異越來越大，但對滇重樓種子的研究主要集中于休眠機理和休眠解除方法，尚未見種子質量的產地變異研究。本試驗收集20個滇重樓種植基地的成熟種子，測定種子形態和發芽率，進行聚類分析，揭示產地與種子質量的關系，以期為滇重樓人工栽培過程中種子質量評價、種源質量的產地劃分和確定優良種源的引種地提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試滇重樓種子2016年10月采自云南、貴州、廣西等地，將新鮮果實采收后用清水搓洗除去果皮和假種皮得凈種子，測定種長、種寬和千粒質量。凈種子分成2份，1份直接做發芽試驗，1份低溫層積3個月后再測發芽率。低溫層積方法是將凈種子與濕珍珠巖按體積比為1 ∶3混合均勻，置于4 ℃恒溫恒濕條件下保存3個月。

1.2 方法

1.2.1 種長和種寬測定 隨機選取凈種子20粒，用電子游標卡尺測定種子縱軸最長處的長度為種長，種子橫軸最短處的長度為種寬，取平均值。

1.2.2 千粒質量測定 隨機選取凈種子1 000粒，用電子天平測定質量，4次重復，取平均值。

1.2.3 發芽率測定 隨機選取種子100粒，清水沖洗干凈，再擺放至內鋪3 cm厚濕潤珍珠巖的發芽盒內，發芽盒置于光照培養箱內，以15、20、25 ℃恒溫或15 ℃/25 ℃變溫，12 h光—12 h暗的交替光照條件培養，每隔15 d補水保持珍珠巖濕潤，置床后每隔30 d檢查種子發芽率，胚根突破種皮2 mm視為萌發，4次重復。

1.3 數據統計和分析

使用Microsoft Excel 2007對數據進行記錄整理，SPSS 18.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地滇重樓種子大小和質量

從表1的結果可見，20份滇重樓種子的平均長度、寬度、千粒質量分別為6.373 mm、4.271 mm、44.54 g。種長最小的是S3，最大的是S12，分別為5.964 mm和7.160 mm。種寬最小的是S14，最大的是S12，分別為4.036 mm和4.648 mm。千粒質量最小的是S1，最大的是S5，分別為34.35 g和51.36 g。由表2的相關性分析結果可知，種長與千粒質量顯著相關，種寬與千粒質量極顯著相關。

表1 滇重樓種子大小和質量

注：同列數據后不同小寫字母代表0.05水平差異顯著。下同。

表2 種子形態的相關性分析

注：“**”表示在0.01水平上(雙尾)相關性顯著，“*”表示在0.05水平上(雙尾)相關性顯著。

2.2 不同產地滇重樓新鮮種子的發芽率

新鮮種子直接點播于珍珠巖發芽床，25 ℃恒溫條件下測得的發芽率結果見表3。由表3可知，滇重樓新鮮種子培養5個月未見種子萌發；第6個月發芽率為2.2%，其中S1發芽率最高，為4.5%，與S3、S5、S6無顯著差異，但顯著高于其他16個采集地的種子(P<0.05)；第7個月發芽率提高至5.2%，其中S2發芽率最高，為7.5%，顯著高于S14、S18(P<0.05)，但與其他17個采集地的無顯著差異；第8個月發芽率增至11.4%，其中S10發芽率最高，為16.0%，S8發芽率最低，僅為9.5%，顯著低于S5、S10、S13號(P<0.05)，但與其他16個采集的種子無顯著差異。結果說明，未低溫層積處理的新鮮種子發芽率較低，發芽時間長，20份種子中除發芽率較低的S8和發芽率較高的S5、S10、S13外，其他多數種子的發芽率無顯著差異。

表3 滇重樓新鮮種子發芽率

2.3 不同產地滇重樓種子低溫層積后的發芽率

4 ℃恒溫恒濕條件下層積3個月的滇重樓種子，在25、20、15 ℃恒溫和15 ℃/25 ℃變溫條件下的發芽率結果見表4。

發芽培養溫度為25 ℃恒溫時：第2個月發芽率均值 3.9%，其中S2發芽率最高，S13最低；第3個月S2發芽率最高，為25.3%，顯著高于S1、S3、S4、S5(P<0.05)，與其他15個采集地無顯著差異；第4個月S9發芽率最高，為52.5%，顯著高于S2(P<0.05)，與其他18個采集地無顯著差異；第5個月發芽率最高和最低的分別是S20和S6，分別為 62.0% 和55.3%，20個采集地之間無顯著差異。

發芽培養溫度為20 ℃恒溫時：第2個月發芽率均值 4.4%；第3個月發芽率升至22.7%，20個采集地之間無顯著差異；第4個月S20發芽率最高，為54.0%，顯著高于S4、S7、S9、S11、S12、S13、S14、S19(P<0.05)，與其他11個采集地無顯著差異；第5個月S17發芽率最高，為65.8%，顯著高于S3、S4、S6(P<0.05)，與其他16個采集物無顯著差異，S3發芽率最低，為59.0%，顯著低于S17和S19(P<0.05)，與其他17個采集地之間無顯著差異。

發芽培養溫度為15 ℃恒溫時：第2個月發芽率均值僅為1.9%；第3個月S12發芽率最高，為15.0%，顯著高于S1、S3、S4、S5、S10、S11、S16(P<0.05)；第4個月發芽率均值升至 23.7%，20個采集地之間無顯著差；第5個月20個采集地之間無顯著差異。

表4 滇重樓層積種子發芽率 %

發芽培養溫度為15 ℃/25 ℃變溫時：第2個月發芽率為3.5%；第3個月發芽率迅速上升至31.9%，其中S2發芽率最高，為35.5%，顯著高于S5、S13、S14、S18(P<0.05)，與其他15個采集地無顯著差異；第4個月S12發芽率最高，為 68.8%，顯著高于S6號(P<0.05)，與其他18個采集地無顯著差異；第5個月S18發芽率最高，達73.0%，顯著高于S13、S20(P<0.05)，與其他17個采集地無顯著差異，S20發芽率最低，為67.0%，顯著低于S18(P<0.05)，與其他18個采集地無顯著差異。

低溫層積種子在不同發芽溫度下的發芽率差異性分析結果見表5，置床后150 d，15 ℃/25 ℃變溫條件下發芽率顯著高于20、25、15 ℃恒溫(P<0.05)。結果說明，低溫層積處理后種子發芽率提高，較為適宜的發芽培養溫度條件是15 ℃/25 ℃變溫。

表5 滇重樓層積種子在不同溫度下的發芽率差異性分析 %

2.4 滇重樓種子聚類分析

以千粒質量、低溫層積種子在15 ℃/25 ℃變溫培養5個月的發芽率進行組內聯接的平方歐氏距離聚類分析，結果見圖1。按滇重樓的產地來源可將其種子劃分為3類，第1類包括S1、S2、S3、S6、S7、S14、S17和S20，這8個產地滇重樓特點是種子粒徑小、質量小、發芽率較低；第2類包括S4、S5、S9、S11、S12、S13、S16，這7個產地滇重樓特點是種子粒徑大、千粒質量大、發芽率處于中等水平；第3類包括S8、S10、S15、S18和S19，這5個產地特點是種子中等大小、種子發芽率較高。

3 結論和討論

我國有重樓屬植物19種18變種，其中滇重樓和七葉一枝花分布較廣，分布區域包括云南、四川、貴州、湖北、甘肅等地[18]，本研究中20份種子的產地分別為云南、貴州、廣西，均是滇重樓主產區。由于各產地間的溫度、光照、降水量、土壤條件等環境條件各不相同，為適應不同的環境條件，植物可能產生一些遺傳變異，并將穩定的遺傳變異反映在種子品質上[19]。對藥用植物來說，種子質量是實現藥材高產高效栽培的基礎，更是保證藥材藥效品質純正穩定的源頭。因此，研究不同產地的種子質量差異對研究不同產地環境下藥用植物品質評價具有重要意義，也對優良種質篩選和高產高效栽培過程中種源產地劃分和引種地的選擇具有指導意義。

我國農作物種子質量評價體系常用的指標是純度、凈度、水分和發芽率[20-22]，本研究首先測定了新鮮滇重樓種子的形態，包括種長、種寬和千粒質量，發現種子大小和質量呈顯著的正相關關系。然后對滇重樓種子發芽特性進行研究，發現新鮮種子在第5個月時仍未見發芽，8個月平均發芽率僅11.4%，低溫層積種子發芽率顯著提高，發芽時間縮短，尤其是發芽溫度為15 ℃/25 ℃變溫時，5個月的平均發芽率為69.8%。根據以上結果，在種長、種寬、千粒質量等3個顯著性相關的指標中選取千粒質量，選取層積種子15 ℃/25 ℃發芽率，作為評價滇重樓種子質量的主要指標。綜合千粒質量和發芽率指標聚類分析，可將20個產地的滇重樓種子劃分為3類，第1類來源于貴州六盤水和云南文山，特點是種子小、發芽率低；第2類主要來源于廣西百色、云南文山，特點是種子大、發芽率中等水平；第3類來源于包括云南西北部和中部，特點是種子中等大小、種子發芽率偏高。

本研究僅從種子外觀大小、千粒質量、發芽率上做了分析，在種子內部解剖結構、貯藏的營養物質成分和含量以及轉錄組、蛋白組和基因組等方面的差異有待以后進一步研究。