基于流式細胞術的旱柳染色體倍性與基因組大小測定

張 健， 王 瑩， 馬祥建， 談 峰， 李 敏， 李玉娟

(江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇南通 226541)

柳樹是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)樹種，為落葉喬木或灌木，主要分布在北半球溫帶及寒帶地區，在北半球熱帶、亞熱帶地區及南半球也有少量分布。全球有500多個柳樹品種，其中亞洲是柳樹的起源中心，僅我國就有275種[1]。柳樹樹種間存在豐富的染色體倍性差異，包括二倍體(2n=2x=38)、四倍體(2n=4x=76)、六倍體(2n=6x=114)甚至十二倍體(2n=12x=228)[2]，其中灌木柳主要為二倍體，喬木柳多為異源多倍體[1，3]。

旱柳(Salixmatsudana)是柳屬最重要的樹種之一，主要為喬木柳[4]，原產我國東北部，又被稱為中國柳，以其高適應性特別是抗逆性已被引種推廣到澳大利亞、歐洲與北美洲等地區[5]，是重要的能源、造林和綠化樹種[6]。旱柳在土壤重金屬修復、鹽堿地綠化、生物燃料等方面發揮著重要作用[7-8]，其中海柳1號、9901柳等品種已逐漸成為我國沿海林業開發中潛力巨大的戰略樹種[9-10]。目前，科研人員已開展了旱柳生理指標如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,簡稱SOD)活性、過氧化氫酶(peroxidase，簡稱POD)活性、丙二醛(malondialdehyde，簡稱MDA)含量在鹽脅迫下的表現[9]以及轉錄組[11]、比較蛋白組[5]及miRNA[12]等方面的研究，但旱柳的染色體倍性與基因組大小尚未見報道，這限制了旱柳分子育種的發展。

流式細胞術(flow cytometry，簡稱FCM)是一種在液流系統中快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術，其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞染色體倍性、DNA含量、細胞體積、蛋白質含量等許多重要參數[13]。流式細胞術已在山藥、芭蕉等植物的染色體倍性檢測與基因組大小測定中發揮了重要的作用[14-15]。

本研究運用流式細胞術對旱柳不同品種的染色體倍性與基因組大小進行測定，以期為旱柳全基因組測序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

旱柳品種選用江蘇省地方旱柳品種沿江柳、江蘇沿江地區農業科學研究所育成的旱柳品種海柳1號、山東省林業科學研究院育成的旱柳品種9901柳。旱柳染色體倍性測定以東北地方灌木柳品種杞柳(已知為二倍體)為對照，基因組大小測定以基因組大小已知的水稻淮稻5號(江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所育成)和大豆品種通豆7號(江蘇沿江地區農業科學研究所育成)為對照。

1.2 培養條件

染色體倍性測定時，分別取杞柳與旱柳各品種的莖段扦插條(粗2～3 cm，長8～10 cm)，放入含1/3清水透明杯中并置于光照培養箱中培養，培養條件：光暗周期為12 h—12 h，光照度為3 300 lx，培養溫度為25 ℃。

基因組大小測定時，取水稻品種淮稻5號、大豆品種通豆7號的籽粒，用培養皿加水后放入光照培箱內培養；同時取旱柳3個品種莖段，培養方式與上述一致。

1.3 染色體倍性及基因組大小測定

上述材料培養時間均為20 d，培養后取新鮮嫩葉，采用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)進行染色體倍性和基因組大小測定，并用CellQuest軟件(美國BD公司)獲取數據，用ModFit軟件(Yerity Software House公司)分析結果。

單細胞懸液：取1 g植株新鮮葉片，在2 mL細胞裂解液中用鋒利的刀片切碎，用200目尼龍網過濾，用試管收集濾液，經1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，收集沉淀細胞核。

混合液：先用碘化丙啶(propidium iodide，簡稱PI)染液對細胞核重懸，將細胞核懸液DNA進行熒光標記，置于暗處染色 20 min。再將幾個品種的染液進行混合形成混合液。

用已知染色體倍性或基因組大小的材料作為對照，將對照材料橫坐標固定，保持各個參數一致后對待測樣品逐一檢測，根據峰的位置并參考對照樣品的大小計算待測樣的倍性與基因組大小。

2 結果與分析

2.1 旱柳染色體倍性分析

用流式細胞儀測定杞柳(二倍體)的DNA含量時將其設定為50附近，以二倍體杞柳的DNA含量為對照，將其他待測旱柳品種的DNA含量與其進行比較，得到所測樣品的相對DNA含量。從圖1可以看出，杞柳在50左右有1個主峰(圖1-a)，海柳1號、9901柳和沿江柳3個旱柳品種均在100左右出現了主峰，代表其倍性約為杞柳的2倍，即3個旱柳品種均為四倍體。

2.2 旱柳基因組大小預測

2.2.1 水稻、大豆、沿江柳基因組比較 用流式細胞儀測試水稻細胞的單細胞懸液，已知水稻基因組大小約為 440 Mb[16]，所得的DNA含量定為44左右，并以此為對照，測定大豆(已知其基因組大小約為1 150 Mb[17])和沿江柳的DNA含量，并將沿江柳的DNA含量分別與水稻和大豆的DNA含量進行比較，得到沿江柳的相對DNA含量，結果見圖2-a、圖2-b、圖2-c。用流式細胞儀對沿江柳與水稻、大豆進行了混合樣測定，將最小基因組的水稻DNA定量為50左右，得出圖2-d的混合樣圖。

從圖2-a、圖2-b、圖-2c可以看出，水稻的G1期(細胞分裂間期1)在圖2-a中橫坐標46.49處，大豆的G1期位置在143.56處，沿江柳的G1期位置在75.60處，從水稻推算沿江柳的基因組大小為440/46.49×75.60=715.5 Mb；從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/143.56×75.60=605.6 Mb。

從圖2-d可以看出，水稻G1期的位置在52.27處；大豆G1期位置在138.74處，沿江柳的基因組介于兩者之間，峰值在80.44處。從水稻推算沿江柳的基因組大小為440/52.27×80.44=677.1 Mb，從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/138.74×80.44=666.8 Mb。

2.2.2 水稻、大豆、9901柳、海柳1號單細胞懸液比較 為了更準確地測定出旱柳基因組大小，筆者重復測定了水稻、大豆的單細胞懸液，并將9901柳、海柳1號這2個旱柳品種與其進行比較。

從圖3可以看出，水稻G1期的位置在圖中橫坐標45.10處，大豆的G1期位置在135.00處，9901柳的G1期位置在74.32處，海柳1號的G1期位置在74.11處。從水稻推算9901柳的基因組大小為440/45.10×74.32=725.1 Mb；推算海柳1號的基因組大小為440/45.10×74.11=723.0 Mb。從大豆推算9901柳的基因組大小為1 150/135×74.32=633.1 Mb；推算海柳1號的基因組大小為1 150/135×74.11=631.3 Mb。

2.2.3 水稻、大豆、9901柳、海柳1號混合樣比較 試驗同時用流式細胞術對水稻、大豆與9901柳或海柳1號三者的混合樣進行測定，并根據測定圖計算其基因組大小值。

從圖4-a可以看出，水稻G1期位置在圖中橫坐標 50.56處，大豆G1期位置在139.83處，9901柳的基因組介于兩者之間，峰值在81.02處。從水稻推算9901柳的基因組大小為440/50.56×81.02=705.1 Mb，從大豆推算沿江柳的基因組大小為1 150/139.83×81.02=666.3 Mb。

從圖4-b可以看出，水稻G1期位置在圖中橫坐標 51.28處，大豆G1期位置在144.61處，海柳1號的峰值在81.87處。從水稻推算海柳1號的基因組大小為440/51.28×81.87=702.5 Mb， 從大豆推算海柳1號的基因組大小為1 150/144.61×81.87=651.1 Mb。

3 討論與結論

柳樹是我國主要的鄉土樹種之一，在我國有著悠久的栽培歷史。多倍體現象在柳樹的物種形成中非常普遍，在已知染色體數目的65種柳樹中，2倍體有16種、3倍體有10種、4倍體有43種、5倍體有3種、6倍體有10種、8倍體有7種、10倍體有3種、12倍體有1種[2]。了解柳樹的倍性對其重要性狀的數量性狀座位分析以及全基因組測序有著重要意義，本研究利用流式細胞術以已知二倍體杞柳為對照，測定出旱柳3個品種海柳1號、9901柳和沿江柳均為四倍體。

由于倍性的關系，使得柳樹基因組大小差距較大，已知柳樹基因組的大小在342～841 Mb之間，如三蕊柳(Salixtriandra，二倍體)的基因組大小為386 Mb[18]，簸箕柳(Salixsuchowensis，二倍體)的基因組大小為425 Mb[19]，垂柳(Salixbabylonica)的基因組大小為748 Mb[20]，白柳(Salixalba，四倍體)的基因組大小為807 Mb[18]。本研究中，筆者運用流式細胞術將旱柳3個品種(沿江柳、9901柳、海柳1號)與基因組大小已知的水稻(基因組大小為440 Mb)和大豆(基因組大小為1 150 Mb)分別進行了對比測定，單液測定結果顯示旱柳的基因組大小為605.6～725.1 Mb，混合液測定結果顯示的旱柳的基因組大小為651.1～705.1 Mb。綜合以上數據，推測旱柳的基因組大小應該在670 Mb左右。