TGF—β信號通路促進小鼠乳腺癌活檢相關性肺轉移的實驗研究

傅永強　郭方明　陳浩浩

[摘要] 目的 探討空芯針穿刺活檢（core needle biopsy，CNB）對乳腺癌遠處轉移的影響及其可能機制。 方法 30只BALB/c小鼠采用乳腺癌4T1細胞乳腺脂肪墊接種， 分成活檢與非活檢兩組，活檢組應用CNB建立活檢相關肺轉移模型，采用流式細胞術、qPCR及形態學等檢測技術從腫瘤組織局部和整體水平評價其生物學行為。 結果 成功建立穩定而可靠的乳腺癌肺轉移模型，活檢組小鼠肺轉移結節數顯著高于非活檢組（P<0.05）；與非活檢組相比，活檢組小鼠TGF-β1、SOX-4及EZH2的mRNA表達上調（P<0.05），流式細胞術檢測的NK細胞增加，但差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 CNB可通過TGF-β信號通路介導的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等機制促進乳腺癌的肺轉移。

[關鍵詞] 乳腺癌；肺轉移；活檢；上皮間質轉化；小鼠

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）23-0028-05

Experimental sudy on the TGF-β signaling pathway in promoting mice breast cancer biopsy-related lung metastasis

FU Yongqiang1 GUO Fangming1 CHEN Haohao1 FU Xiaoyan1 HE Guochan1 ZHANG Hui2 FANG Yuanshu2 YING Xiaoqian1 ZHANG Ning1 DING Mingxing1

1.Jinhua Polytechnic Medical School， Jinhua 321007， China； 2.Jinhua Institute of Food and Drug Test Center in Zhejiang Province， Jinhua 321007， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of core needle biopsy（CNB） on distant metastasis of breast cancer and its possible mechanism. Methods 30 BALB/c mice were inoculated with mammary fat pad of breast cancer 4T1 cells. They were divided into biopsy group and non-biopsy group. The biopsy group was given CNB to establish a biopsy-related lung metastasis model. Flow cytometry， qPCR， and morphological techniques were used to evaluate the biological behavior by the local and global levels of tumor tissues. Results After successfully establishing a stable and reliable breast cancer lung metastasis model， the number of lung metastatic nodules in the biopsy group was significantly higher than that in the non-biopsy group（P<0.05）； Compared with non-biopsy group， mRNA expression of TGF-β1， SOX-4 and EZH2 in the biopsy group was up-regulated（P<0.05）. NK cells detected by flow cytometry were increased， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion CNB can promote lung metastasis of breast cancer through TGF-β signaling pathway-mediated epithelial-mesenchymal transition （EMT） and other mechanisms.

[Key words] Breast cancer； Pulmonary metastasis； Biopsy； Epithelial-mesenchymal transition （EMT）； Mice

乳腺癌的發病率和致死率均高居女性惡性腫瘤首位，轉移和侵襲是其致死的主要原因，故篩查和早期檢測對于改善患者預后及生活質量極為關鍵[1，2]。其中空芯針穿刺活檢（core needle biopsy，CNB）是目前主要的活檢方法，但其對臨床患者結局的影響和潛在風險尚有爭議，CNB可增加乳腺癌患者腫瘤細胞的針道種植及穿刺部位皮膚轉移的機會，并有促進腫瘤局部復發及遠處轉移的風險[3，4]。其機制可能涉及一系列腫瘤細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的相互作用過程，而TGF-β信號通路通過其下游的多種轉錄因子介導的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺癌發生及轉移中有重要作用[5]。新近發現，SOX轉錄因子中SOX-4參與調控TGF-β1誘導的人乳腺上皮細胞EMT過程，通過EZH2基因表觀遺傳修飾發揮作用，可作為臨床三陰性乳腺癌的潛在生物標志[6，7]。本文應用小鼠乳腺癌4T1細胞乳腺脂肪墊接種結合CNB建立活檢相關肺轉移模型[8]，從TGF-β1、SOX-4及EZH2等基因活化程度證實EMT的促進遠處轉移效應，為正確評價乳腺癌活檢及手術的有效性與安全性、探討乳腺癌肺轉移的生物學機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 小鼠乳腺癌細胞株4T1由中國科學院上海細胞庫提供，L-谷氨酰胺、雙抗、Dulbecco's Modified Eagle Media（DMEM）培養基、胎牛血清（均為Gibco公司產品，美國），高純總RNA快速提取試劑盒（Generay公司，GK3016），逆轉錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR（Vazyme公司，R222-01），qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Vazyme公司，Q411-02），實驗引物由上海桑尼生物科技有限公司合成、純化，Anti mouse CD49b-APC抗體（ebio公司，17-5971-81），Anti mouse CD3-FITC抗體（ebio公司， 11-0032-80），流式細胞儀（Accμri C6，BD公司），顯微鏡（BX43型，OLYMPUS公司），隔水式恒溫培養箱（PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海躍進醫療器械有限公司）。

1.1.2 實驗動物及飼養 30只4～6周齡雌性BALB/c小鼠由上海斯萊克有限公司提供，生產許可證號為SCXK（滬）2012-0002，合格證號：0300203；SPF級，購入時動物體重為16～20 g。飲用水為滅菌二級超純水，飲用水質量符合中華人民共和國國家標準《生活飲用水衛生標準》[9]GB5749-2006）的規定。實驗動物房使用許可證號為SYXK（浙）2015-0008，飼養環境：溫度范圍20℃～25℃，相對濕度范圍40%～70%。維持飼料：由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，執行標準GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養成分》[10]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清100 IU/mL青霉素，100 g/mL鏈霉素的DMEM培養基作為4T1細胞的培養液，于5% CO2，37℃細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 小鼠乳腺原位腫瘤及肺轉移模型的建立 BALB/c小鼠采用1%戊巴比妥鈉（Merck，上海化學試劑公司進口分裝，CAS號57-33-0）（6 μL/g）腹腔內注射麻醉麻醉成功后，在嚴格無菌操作下于胸部正中處切開2 cm大小的切口，鈍性分離至雙側乳房脂肪墊處準備接種細胞；收集處于對數生長期的4T1細胞，1000 rpm離心5 min，調整細胞濃度至2×105個/mL制備單細胞懸液，以1 mL空針將細胞懸液吹打混勻后，取0.05 mL接種于小鼠第3對乳房脂肪墊處，雙側各含細胞數1×104個，注射部位出現明顯皮丘后縫合切口。接種3周后，大部分小鼠瘤徑達到6 mm左右，可進行后續實驗。

1.2.3 活檢處理及腫瘤切除 BALB/c小鼠30只分為兩組，即：活檢組和非活檢組，每組各15只。活檢處理：小鼠采用1%戊巴比妥鈉（Merck，上海化學試劑公司進口分裝，CAS號57-33-0）（6 μL/g）腹腔內注射麻醉，3～5 min麻醉成功后，瘤體側朝上固定小鼠，使用碘伏進行瘤體部位局部消毒，進行無菌手術準備，用帶有5 mL注射器18號針頭CNB空芯針進行腫瘤穿刺，穿刺入針點于腫瘤中心位置，然后于掌狀輻射方向6～8個來回并保證穿刺在腫瘤的平均分布；非活檢處理：作為對照不接受穿刺，但同樣經受完全麻醉的手術準備過程，在相同實驗室持續相同時間。

上述所有活檢和非活檢小鼠在穿刺后7 d進行腫瘤切除手術：小鼠同樣采用上述方法麻醉成功后，使用碘伏進行全身性消毒，在嚴格無菌操作下于胸部正中處切開2～3 cm大小的切口，手術切除乳腺腫瘤，清除所有腫瘤組織以免局部復發，術后縫合切口，再次使用碘伏進行消毒防止造成傷口感染。

1.2.4 形態及組織病理學檢查 切除的腫瘤組織液氮冷凍保存，用于后續PCR及免疫組化等組織病理分析。從腫瘤細胞接種到乳腺腫瘤切除期間每天觀察乳腺腫瘤生長情況，每周測量腫塊的大小。按公式V=1/2×長×寬×寬，計算雙側腫瘤大小并繪制生長曲線[11]。活檢后1周開始每周處死3只小鼠直至處死全部小鼠。

腫瘤生長至45 d，將小鼠安樂死后取出肺，在解剖顯微鏡下計數肺轉移結節數量并測量轉移瘤直徑，進行分類計數，公式如下：肺表面轉移結節總數=I×1+Ⅱ×2+Ⅲ×3+Ⅳ×4（據肺結節直徑將其分為4級：I級<0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ級<1 mm，1 mm≥Ⅲ級≤2 mm，Ⅳ>2 mm）。取出的腫瘤組織、肺臟標本，浸于10%中性福爾馬林中充分固定48 h，常規石蠟包埋切片，HE染色，400倍光鏡下觀察。

1.2.5 熒光定量PCR RNA提取、純度的測定和RNA的定量：按Trizol操作說明，Trizol-離心柱法提取樣本總RNA用于qPCR。以相應溶劑為對照（Blank），取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量：A260/A280>2.0且<2.3，則可以滿足后續RT-qPCR所需。

熒光定量PCR擴增實驗：逆轉錄實驗中的RT反應液：5×HiScriptR Ⅱ qRT SuperMix 4 μL，Total RNA≤1000 ng，RNase Free dH2O加至20 μL。

各基因引物序列見表1。PCR擴增反應體系：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，Forward primer，10 μM，0.6 μL，Reverse primer，10 μM，0.6 μlTemplate cDNA 8.8 μL，ddH2O加至20 μL。qPCR實驗參數：95.0℃ for 30 s，95.0℃ for 10 s，60.0℃ for 30 s Plate Read，GOTO 2，40 reps，Melt Curve 70℃ to 95℃：Increment 0.5℃ for 5 s Plate Read。見表1。

1.2.6 流式細胞術 取小鼠脾臟，剔除脂肪組織后剪成5 mm×5 mm小塊，收集脾臟細胞懸液，300×g，10 min，收集細胞沉淀，無血清培養基重懸后過200目篩網；將細胞懸液慢慢滴入等體積的分離液中，水平離心，500×g，20 min，收集第二層白色細胞懸液，棄紅細胞層。5倍體積洗滌液重懸細胞，300×g，5 min，漂洗細胞2遍，100 μL staining bμffer重懸細胞，置于冰上，待孵育抗體。同時加入CD49b-APC和CD3-FITC抗體，室溫避光孵育30 min。另設CD49b-APC單染組和CD3-FITC單染組和空白組（不加任何抗體）。300×g，5 min，離心收集上述組別的細胞沉淀；500 μL staining buffer重懸細胞，以FL-1A通道檢測CD3-FITC信號，FL-4A通道檢測CD49b-APC信號。空白組用以確定陰性區域，相應一抗單染組確定陽性表達區域，NK細胞為CD49b陽性CD3陰性細胞（散點圖中UL區域）。

1.3 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，對于單變量分析中，分類變量采用χ2檢驗及Mann-Whitney U檢驗，連續變量用兩兩t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠乳腺癌細胞株4T1活檢相關性肺轉移模型的建立

結果表明，乳腺癌細胞株4T1細胞接種14 d后成功建立小鼠乳腺癌原位瘤模型。活檢處理7 d后，活檢組小鼠腫瘤瘤體積大于非活檢組小鼠腫瘤瘤體積，但差異無統計學意義（P>0.05）。手術切除腫瘤后小鼠狀態較差，活檢組有1例死亡，成活率為93.33%（14/15），非活檢組全部存活（圖1）。

2.2 活檢組與非活檢組遠處轉移情況

上述兩組于活檢后1周開始每周處死3只小鼠直至處死全部小鼠，開胸取肺觀察，全部小鼠均發生肺轉移，計算肺表面轉移結節數，結果見表2；HE染色光鏡觀察可見肺內有腫瘤細胞轉移灶，與正常肺組織相比，轉移瘤細胞排列緊密、核大深染、核膜清晰、核仁明顯，分裂相多見，病理組織學診斷為浸潤性癌巢，見圖2。活檢組與非活檢組累計轉移肺結節計數分別為35個和24個，差異有統計學意義（Mann-Whitney U檢驗，Z=-3.29，P<0.05）（表2）。各組小鼠淋巴和心臟組織均有發生癌細胞轉移，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 qPCR檢測活檢組和非活檢組裸鼠乳腺腫瘤及肺組織中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表達

活檢組小鼠乳腺腫瘤組織中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表達上調，與非活檢組組比較差異均有統計學意義（P<0.05），但兩組小鼠肺組織中TGF-β1、SOX-4、EZH2的mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 流式細胞儀檢測脾臟NK細胞（CD49b+CD3-）的比例

活檢組手術后1周和手術后2周含量與手術當日比較，NK細胞有上升趨勢（P<0.05），而非活檢組手術后2周含量與手術當日比較，NK細胞有上升趨勢（P<0.05）；相同時間點樣本，活檢組NK細胞含量低于非活檢組，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表4，圖3。

3 討論

CNB的應用盡管可以在早期確診乳腺癌，但長期以來，與執行CNB相關的臨床效果和潛在風險一直備受爭議。有報道CNB增加了乳腺癌患者針道播種和局部腫瘤復發的風險，但乳腺癌細胞是否在活檢程序后進入淋巴管并遷移到淋巴結，從而通過淋巴管和血管通道有效建立遠處轉移尚未得到證實[3，4]，故其增加腫瘤局部復發及遠處轉移的風險尚需更多的證據[12]。

本研究首先將小鼠乳腺4T1腫瘤細胞同位移植到BALB/c小鼠中，并且在2周內腫瘤生長后試驗性地復制使用CNB，以模擬臨床進行活組織檢查。在這個模型實驗中，腫瘤自發地從乳腺脂肪墊轉移到淋巴結，肺和心臟等，與人乳腺癌中觀察到的情況類似[13]。在成功建立4T1細胞株BALB/c小鼠轉移性乳腺癌模型后，本研究評估了CNB對以下病理機制的影響：（1）發生肺、淋巴結及心等遠處轉移情況；（2）腫瘤微環境中細胞和細胞因子等免疫狀態的改變；（3）涉及EMT公認的TGF-β1、SOX-4、EZH2等分子的表達，最終從小鼠局部與整體的評價該模型，為進一步的研究奠定基礎。

本研究結果表明，與無活檢組小鼠相比，CNB在小鼠乳腺癌中能顯著增加肺、淋巴結及心等遠處轉移的發生率。既往研究表明，類似這些轉移的增加與腫瘤微環境內的早期免疫抑制性變化相關，這些變化包括炎癥反應、募集骨髓來源的抑制性細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）和伴隨的NK細胞的下調，并有證據支持CNB通過激活EMT的基因（包括涉及TGF-β發起的SOX-4/EZH2，EMT途徑）的基因上調后促進早期轉移的機制[6，7，10]。在荷瘤小鼠中已發現脾臟T細胞的顯著減少及巨噬細胞的增加，但未見有任何與活檢相互作用而發生改變的報道[14]。本研究發現，活檢后小鼠脾內的NK細胞有下降趨勢，提示可能產生了免疫抑制，推測這些變化與這種活檢后細胞因子譜變化有關，造成有利于親轉移性腫瘤微環境[15]。新近研究表明，與4T1細胞相比，腫瘤干細胞可以有效激活血小板，誘導血小板分泌更多的TGF-β1，降低NKG2D的表達，抑制NK細胞的抗腫瘤活性[16]。但其進一步的確切機制尚待研究。

進而，本研究的qPCR結果發現，活檢后TGF-β1的表達及與之相關SOX-4、EZH2等mRNA顯著增加，而這些目前認為是主要的EMT調節因子[17]。這些發現表明通過TGF-β1/SOX-4 EMT途徑的激活，可能有助于循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）的遷移和外滲，從而增加轉移的機會[18]。SOX-4除了能夠激活TGF-β信號通路外，還能夠將癌癥上皮細胞轉變成腫瘤干細胞，SOX-4提高了CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞的比例，表明SOX-4能夠誘導乳腺上皮細胞產生具有干細胞特性的細胞[19]。以前的研究表明，SOX-4的表達與早期淋巴結陰性患者的轉移相關結果差有關，而另一項研究則將SOX-4表達與三陰性乳腺癌患者相關聯，因此作為預后差的標記[6，7]。SOX4可與EZH結合，促進EZH2表達，增加H3K27me3誘導EMT發生[7]。EZH2作為果蠅Zeste基因增強子的人類同源物，具有組蛋白甲基轉移酶活性，可通過抑制E-cadherin的表達直接誘導EMT發生，促進腫瘤轉移[20]。結合這些研究，我們的發現證實EMT和相關分子在CNB誘導的乳腺癌轉移中起關鍵作用，EMT允許腫瘤細胞轉化為侵襲性間充質表型，從而滲入循環系統及遠處器官。新近認為miRNA在乳腺癌細胞SOX-4 EMT中起重要的調節作用[21]，可能為將來研究的突破點。EMT調控因子SOX-4和EZH2在乳腺癌組織中表達上調，有望成為預測乳腺癌轉移的潛在生物學標志物[22，23]。

總之，我們的實驗結果證明，乳腺癌小鼠模型中CNB與肺轉移的發生率顯著增加有關，其機制可能與CNB具有免疫抑制和促轉移性腫瘤微環境，且升高TGF-β1/SOX-4相關的EMT水平有關。

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（收稿日期：2018-02-07）