維生素D受體與慢性阻塞性肺病易感性的關聯

鄭蓉蓉

(南京醫科大學附屬江蘇盛澤醫院, 江蘇 蘇州, 215228)

慢性阻塞性肺病(COPD)主要表現為喘氣、胸悶，嚴重時可導致呼吸困難[1], COPD的病變機制至今仍未完全明確。臨床研究[2]發現, COPD患者缺乏維生素D的現象較為常見，維生素D與維生素D受體(VDR)結合，才能發揮其生物學功能。維生素D可與這些VDR結合，參與呼吸系統的免疫功能調節[3]。VDR分子的表達受其基因單核苷酸多態性(SNP)調控[4], 目前關于維生素D受體基因多態性與COPD易感性的研究較少，本研究采用病例對照研究分析了維生素D受體及其基因多態性與COPD易感性的關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月—2017年6月本院門診收治的COPD患者129例作為病例組，患者均符合COPD相關診斷標準，且排除心腦血管疾病、肝腎系統疾病及其他嚴重肺部疾病。對照組按照年齡、性別匹配，選取同一時期在該院體檢中心參加體檢的健康人群139例。所有對象空腹采集5 mL的EDTA抗凝血，并在收集血液標本的同時，由經專門培訓的調查員完成流行病學問卷調查。

1.2 實驗方法

采用實時熒光定量PCR檢測50例患者和50例對照者的外周血單個核細胞(PBMC)中VDR mRNA表達情況，反應在ABI 7500 PCR儀中進行，熒光定量PCR的結果以每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數Ct值表示。Ct值減去管家基因β-actin的Ct值得到△Ct, △Ct值越小, VDR基因表達量就越高。采用酚-氯仿法提取所有研究對象細胞基因組DNA。結合在漢族人群中研究過的多態性位點以及從NCBI、HapMap等數據庫中提供的有關VDR基因位點基因型數據，最終選定FokI與ApaI各3個位點。運用TaqMan-MGB熒光探針PCR法檢測所有研究對象的FokI與ApaI位點基因型。反應在ABI 7900 PCR儀中進行，采用SDS2.3軟件讀取檢測數據。

1.3 統計學分析

應用EpiData3.10、SPSS17.0、PHASE 2.0軟件對數據進行處理。采用t檢驗比較COPD組與健康對照組中的VDR mRNA表達水平。采用多因素Logistic回歸分析VDR基因多態性在對照組與病例組中的分布差異。采用協方差分析VDR mRNA在VDR基因陽性位點不同基因型組別中表達情況。

2 結 果

2.1 研究對象的基本情況

2組人群年齡、性別及吸煙的分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。以研究對象每天吸煙支數×吸煙年數計算出吸煙指數，吸煙指數≥400代表大量吸煙, <400代表輕度吸煙。結果顯示，病例組的吸煙指數和健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組與健康對照組一般情況比較

2.2 VDR mRNA在病例組與對照組中表達分布情況

采用熒光定量PCR檢測50例COPD患者與50例對照者PBMC中的VDR mRNA, 結果發現, COPD患者中VDR mRNA△Ct值為(9.12±0.92), 對照者VDR mRNA△Ct值為(7.29±1.03), COPD患者中VDR mRNA的表達量顯著低于對照者，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 VDR基因多態性與COPD易感性的關聯

多因素Logistic回歸分析結果顯示, FokI點Ff基因型在病例組中的分布顯著高于健康對照組(調整OR=1.96, 95%CI=1.32～2.92)(P<0.05), 未發現ApaI位點各基因型在對照組與病例組中分布存在差異。見表2。

表2 VDR基因多態性與COPD易感性的關聯分析

與健康對照組比較, *P<0.05。

2.4 VDR基因FokI位點不同基因型組別中

VDR mRNA表達情況

采用方差分析方法分析陽性位點FokI不同基因型組別中VDR mRNA表達情況，結果發現，對照組與病例組FokI位點不同基因型中VDR mRNA表達水平存在統計學差異(P<0.01), 見表3。

表3 VDR mRNA水平在FokI位點不同基因型中的分布

與對照組比較, **P<0.01。

3 討 論

COPD的發病機制尚未完全清楚，但已有研究表明COPD是由多種炎癥細胞介導、炎癥細胞因子參與的呼吸道慢性炎癥[5]。1, 25-(OH)2D3是體內維生素D的活性形式，除在機體調節鈣代謝方面發揮重要作用外，其也積極參與機體抗炎、抗分化及免疫調節過程[6]。一方面，在固有性免疫應答中, 1, 25-(OH)2D3通過介導NF-κB信號轉導途徑減少機體干擾素、趨化因子等細胞因子的釋放，從而減輕炎癥反應; 另一方面，在獲得性免疫中，維生素D主要通過與巨噬細胞、樹突狀細胞等結合來發揮作用[7]。

維生素D在體內發揮生物學效應依賴于與VDR的結合。VDR表達異常可影響多種疾病的發生、發展。本研究發現, COPD患者VDR mRNA表達水平顯著低于對照者。王東梅等[8]對11篇有關維生素D與COPD相關性的研究進行Meta分析，結果發現, COPD患者普遍缺乏維生素D, 補充維生素D可顯著改善COPD患者的肺功能，因此可推測COPD患者體內VDR介導的維生素D信號通路傳導可能減弱，進而參與COPD的發病機制。

近年來, VDR基因多態性已被發現與多種炎癥相關疾病的發病風險存在關聯[9]。其中研究最多的是VDR的4個限制性酶切位點FokI、TaqI、BsmI、ApaI[10]。Guy等[11]發現在高加索人群中BsmI位點的突變基因型bb可增加乳腺癌的患病風險。畢雪冰等[12]在漢族人群中發現FokI位點多態性與肺癌的易感性存在關聯。由于TaqI與BsmI突變野生基因型在漢族人群中分布較少，因此本研究只分析了FokI、ApaI位點多態性與COPD易感性的關聯，結果發現, FokI位點雜合基因型Ff在病例組中的分布顯著高于對照組，提示F等位基因可能增大COPD的患病風險。FokI位點位于VDR基因的第2外顯子，已有研究報道其突變可改變VDR翻譯編碼蛋白。進一步采用單倍型分析發現, FokI位點可能在VDR基因單倍型區段中發揮著主效應。FokI位點位于VDR基因第2外顯子，是目前唯一能改變氨基酸序列的位點。該位點發生突變可導致VDR翻譯出的蛋白質比正常編碼少3個氨基酸，從而最終影響維生素D信號通路[13]。本研究也發現, FokI位點的多態性與VDR mRNA表達水平存在關聯，這進一步驗證了其他學者[14]關于FokI位點的多態性與VDR mRNA表達有關，從而影響機體疾病的易感性及嚴重程度的研究。

綜上所述，本研究在漢族人群中選擇VDR基因的2個限制性酶切位點，發現VDR基因FokI位點的遺傳變異與COPD發病風險的關系，為探討候選基因與COPD易感性關系提供了可供參考的范例。但本研究同時也存在著一些不足，如樣本量較小，樣本全部選自醫院，此外本研究只對VDR基因部分區段進行分型，不可避免會產生位點選擇偏倚，因此還需進一步擴大樣本量，同時采用精細作圖方法探索遺傳因素在COPD致病機制中的作用。