體外培育牛黃對慢性阻塞性肺疾病大鼠的保護作用研究※

劉 靈,白 麗,段瑞嫻

(山西省中西醫結合醫院,山西 太原030000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)本質是氣道慢性炎癥。白介素-10(IL-10)是一種抑制性細胞因子,能夠抑制氣道中性粒細胞和肺泡巨噬細胞分泌炎性細胞因子,促進中性粒細胞凋亡,清除肺部炎癥[1]。除了肺部的慢性炎癥、蛋白酶失衡等在COPD發病中起重要作用外,細胞凋亡在COPD的發生、發展過程中也是應當重視的作用機制[2]。體外培育牛黃的性狀、成分、藥效與天然牛黃一致,具有抗炎、抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3]。目前國內外對體外培育牛黃治療COPD的研究較少,本研究采用ELISA法測定大鼠血清IL-10的含量,通過TUNEL技術檢測Ⅱ型肺泡細胞的凋亡,了解體外培育牛黃對COPD的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 分組及模型制備 將體質量(200±30)g清潔級健康雄性8周齡Wistar大鼠50只(購于山西醫科大學動物實驗中心,許可證號:晉SCXK 2015-0001)適應性喂養2周后,按照隨機數字表法分為空白對照組(A組),COPD模型組(B組)、牛黃干預組(C組)、布地奈德(激素)干預組(D組)、牛黃+激素干預組(E組),各組動物的飼養條件相同。B、C、D、E組制備COPD模型[4]。制備2 mg/mL脂多糖溶液[10 mg脂多糖(北京索萊寶科技有限公司)溶解于5 mL 0.9%氯化鈉注射液中],分別于第1、15日注入B、C、D、E組大鼠氣道內,被動吸煙(每日2次,每次間隔2 h,每次點燃12支香煙)。A組:第1、15日在大鼠氣道內注入0.1 mL 0.9%氯化鈉注射液。C組:在每次煙熏前1 h給予體外培育牛黃(武漢健民大鵬藥業有限公司,國藥準字Z20030011)灌胃(將1.5 g體外培育牛黃溶解于6 mL蒸餾水中,配成濃度為250 mg/mL溶液)。D組:在每次煙熏前1 h給予霧化吸入布地奈德(AstraZeneca Pty Lt d)1 mg/d。E組:在每次煙熏前1 h給予體外培育牛黃灌胃(800 mg/kg)和霧化吸入布地奈德1 mg/d。4周后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。

1.2 標本采集及制備

(1)將成功麻醉的大鼠固定于解剖臺上,打開胸腔,心臟取血5 mL,離心分離血清,置于-20℃冰箱中保存。采用ELISA法測定血清中IL-10含量,試劑盒購置于武漢博士德生物。按照ELISA試劑盒說明書操作。

(2)取右肺上葉約1.0 c m×1.0 c m×0.2 c m標本,用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈,置于中性甲醛液中固定24 h,常規石蠟包埋,應用TUNEL法檢測Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡。

1.3 TUNEL法檢測 試劑盒購置于武漢博士德生物。①嚴格按照說明書完成實驗步驟。②結果判定:鏡下細胞核中為棕黃色顆粒的即為凋亡細胞。在400倍光鏡下隨機選取10個視野,再隨機觀察100個Ⅱ型肺泡上皮細胞,凋亡細胞數目/100表示凋亡指數,再計算平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據統計。計數資料以均數±標準差)表示,多組資料進行方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察 A組大鼠活潑好動,食量正常;呼吸平穩,呼吸道無分泌物,未聞及痰鳴音。B、C、D、E組大鼠逐漸出現蜷伏少動,撮毛,食量減少,毛發黃、易脫落,體重較A組減輕;呼吸急促,呼吸道有分泌物從口鼻流出,偶可聞及咳嗽及氣道痰鳴音,隨著造模時間的延長,上述癥狀逐漸加重。

2.2 大鼠肺組織病理切片觀察 A組:肺泡結構正常。B組:可見支氣管纖毛部分脫落,大量炎性細胞浸潤,肺泡腔擴大,肺大泡。C組:局部肺泡擴張、融合,可見少量炎性細胞浸潤,但肺泡融合程度、炎性細胞浸潤和肺泡間隔斷裂等方面較B組減輕。D組:局部肺泡擴張、融合,可見少量炎性細胞浸潤,但是肺泡融合程度、炎性細胞浸潤和肺泡間隔斷裂等方面較B組減輕。E組:少量炎性細胞浸潤,肺泡間隔斷裂及肺大泡的形成比B、C、D組大鼠明顯減輕(圖1見本期第117頁)。

2.3 IL-10檢測結果 與A組比較,其他各組大鼠的IL-10含量增高,差異均有統計學差異(P＜0.05);5組大鼠IL-10含量多重比較,除C組和D組比較無統計學意義外(P＞0.05),其余各組比較組間差別有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組COPD大鼠血清IL-10含量比較

2.4 TUNEL測定Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡指數TUNEL染色顯示細胞核內含有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞(圖2見本期第117頁)。與A組比較,B、C、D、E組大鼠的Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡指數顯著升高,差異有統計學意義(P＜0.05);5組大鼠的Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡指數多重比較均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡指數比較

表2 各組COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡指數比較

注:與A組比較,▲P＜0.05;與B組比較,◇P＜0.05;與C組比較,★P＜0.05;E組與D組比較,△P＜0.05

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3 討論

COPD患者IL-10含量降低及其調控分泌的促炎癥細胞因子的增加可能是氣道持續炎癥并導致氣道重塑、氣流受限、肺組織破壞等病理過程的重要機制[5]。而以肺結構細胞凋亡為特征的肺氣腫改變是導致患者肺殘氣量增加、肺順應性下降等肺功能減退的主要病理基礎[6]。TUNEL法對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征[7]。體外培育牛黃是在仿生學技術基礎上模仿牛膽內的生物環境研制而成,體外培育牛黃對急性炎癥的滲出和慢性炎癥的增生及結構細胞凋亡均有顯著的抑制作用,還能提高機體耐缺氧能力,所以推測體外培育牛黃可能對COPD也具有保護作用[8-9]。

吸煙和感染是引起COPD發病最主要的環境因素。筆者對大鼠進行煙霧刺激并注射脂多糖誘發感染以模擬其病理生理過程,4周后模型組病理改變結果與文獻報道一致,符合COPD病理的特征性表現。本研究結果中5組大鼠血清中IL-10含量多重比較,除C組和D組相互比較無統計學意義外(P＞0.05),其余各組比較組間差異均有統計學意義(P＜0.05),提示體外培育牛黃可以降低COPD的炎癥反應并減輕肺組織的病理損害。本研究結果表明,COPD的發病與肺泡上皮細胞過度凋亡密切相關,而組間比較提示體外培育牛黃可以降低COPD模型大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡,與霧化激素聯合作用更明顯。但體外培育牛黃對COPD的保護作用的量效關系尚需進一步研究探討。