DNA測序診斷孢子絲菌病三例

鄔清芝 孫 毅 曾同祥

孢子絲菌病是一種亞急性或慢性的皮下組織真菌病，是由申克孢子絲菌復合體(sporothrix schenckii complex)引起的皮膚、皮下組織及淋巴系統的亞急性和慢性感染[1]。可通過有創傷的皮膚或開放性損傷的組織感染進行傳播，也可經過人體的呼吸道吸入分生孢子導致肺部感染。孢子絲菌病分為皮膚型和皮膚外型，皮膚型又可分為皮膚固定型、皮膚淋巴管型、皮膚播散型。是皮膚科最常見的感染性肉芽腫性疾病之一，也是最常見的皮下組織真菌病[2,3]。傳統的診斷方法主要根據直接鏡檢、真菌培養及鑒定可明確致病菌種，還可以提供藥物敏感性測試結果，但耗時較長，分子生物學診斷不僅可用于培養菌落的菌種鑒定，還可以用于病變組織的診斷，可縮短診斷時間，明確菌種但后者無法提供藥物敏感性結果，因而不同方法各有利弊[4-6]。本文3例結合了活檢組織直接分子診斷和傳統真菌病原學檢測方法，早期診斷，并進行經驗性抗真菌治療，真菌培養及藥敏進一步證實致病菌種及藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者1，男，60歲，農民。因左手背皮損1年余來我院就診。1年前左手背出現黃豆大皮損，逐漸擴大，曾口服頭孢類藥物和外用多種抗生素軟膏治療無效。否認特殊病史；皮膚科檢查：左手背可見一處2 cm×1 cm暗紅色斑塊，質軟，境界清楚，表面有膿痂(圖1a)；輔助檢查：三大常規、肝腎功能、血糖血脂無異常。

患者2，女, 45歲，農民。因右手背皮損1年來我院就診。1年前右手背出現黃豆大皮損，逐漸擴大，曾在外院口服美滿霉素、頭孢類藥物治療無效；否認特殊病史。皮膚科檢查：右手背見一3 cm×3 cm紅色斑塊，質軟，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結痂(圖1b)；輔助檢查：三大常規、肝腎功能、血糖血脂無異常。

患者3，女,58歲，農民。因左手背及上肢皮損半年余來我院就診。患者半年多前，左手中指出現黃豆大皮損，逐漸擴大，并蔓延至手背、前臂及上臂，曾在外院口服、靜脈滴注頭孢類藥物，及多種中草藥外敷治療無效；高血壓病3年，口服藥物控制；否認其他特殊病史。皮膚科檢查：左手中指指背、手背及前臂均可見1 cm×1 cm～3 cm×1 cm紅色斑塊，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結痂，左上臂可見一1.5 cm×1 cm暗紅色結節；輔助檢查：三大常規、肝腎功能、血糖血脂無異常。

1.2 實驗室檢查

1.2.1 直接鏡檢及培養 真菌直接鏡檢；將皮屑及膿液利用10% KOH直接鏡檢，見少量孢子、未找到菌絲(圖1c、d)；將收集的膿液和皮屑接種于沙氏培養基(含卡那霉素)中，置于27℃培養箱中培養。

1.2.2 活檢組織分子鑒定 取部分活檢組織于1.5 mL離心管中，加入250 μL DNA提取液及少量玻璃珠于漩渦震蕩儀2000 r/min震蕩10 min 后，14000 r/min離心10 min并收集上清；采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術有限公司)提取DNA，方法參考試劑盒說明書；然后PCR擴增：擴增引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[7]擴增所提取真菌DNA的ITS區；將PCR擴增產物送上海生工進行測序，測序結果登錄GeneBank進行Blast比對；比對結果提示申克孢子絲菌。

1.2.3 組織病理學檢查 對3例患者病變部行組織病理檢查，石蠟切片，HE染色，3例病理學特征均為感染性肉芽腫(圖2a、b)；抗酸染色及PAS染色陰性。

1.2.4 真菌培養及形態學鑒定 3例患者的膿液及組織培養1周后均可見菌落生長，轉種于察氏瓊脂培養基中培養行形態學觀察，并進行小培養形態學觀察(圖3)。

a：病例1皮損：左手背可見一2 cm×1 cm暗紅色斑塊，質軟，境界清楚，表面有膿痂；b：病例2皮損：右手背可見一3 cm×3 cm紅色斑塊，質軟，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結痂；c: 病例1皮損處皮屑及膿液直接鏡檢：僅見少量孢子(箭頭)，未見菌絲；d：病例2皮損處皮屑及膿液直接鏡檢：見少量孢子(箭頭)，未見菌絲

圖1 患者皮損臨床圖像及直接鏡檢圖像

圖2 患者組織病理圖像：病例1和2組織病理檢查(HE,×100)：a、b見彌漫混合型炎細胞(中性粒細胞、淋巴細胞、組織細胞等)浸潤圖3 球形孢子絲菌形態學圖像：a：沙氏培養基 27℃ 恒溫培養，10天后可見有灰白色褶皺粉末狀菌落生長;b：見細長分隔菌絲，分生孢子延菌絲呈袖套樣排列(×400)

1.2.5 真菌DNA提取及分子鑒定 同時玻璃珠法分別提取菌株DNA，通過ITS鑒定仍提示申克孢子絲菌；為進一步進行種間鑒定，利用calmodulin基因擴增引物CL1(5’-GA(GA)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC-3’)和CL2A(5’-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3’)擴增及測序鑒定；將測序所得的CAL原始序列于GeneBank中進行比對，鑒定其為球形孢子絲菌。

1.2.6 藥物敏感性檢測 參照美國臨床實驗室標準化研究所(clinical and laboratoty standards institute，CLSI)的M27-A3和M38-A2方案進行[8,9]。質控株為近平滑念珠菌ATCC 22019。測試藥物：伊曲康唑(sigma-aldrich，批號84625-61-6，純度>99%)、特比萘芬(sigma-aldrich，批號78628-80-5，純度>99%)及伏立康唑(sigma-aldrich，批號182369-73-9，純度>99%)。

1.2.7 糖同化實驗 收集孢子懸液并用血細胞計數板計數，菌懸液濃度為1×105～1×106CFU/mL；在YNB培養基中加入5%不同糖(葡萄糖、蔗糖、棉籽糖)；將孢子懸液加入含不同糖的YNB中，28℃孵育至第 5 天后培養基由澄清變為渾濁則說明同化試驗陽性，如仍保持澄清則同化試驗陰性[10]。三個受試菌株蔗糖同化試驗陽性、棉籽糖同化試驗陰性。

2 診斷與治療

該3例患者膿液中存在少量孢子，本文根據早期病變組織的分子診斷結果及臨床表現診斷為孢子絲菌病，給予患者特比萘芬口服250 mg/d；舍他康唑乳膏外用；早期的分子鑒定利用ITS測序為申克孢子絲菌，與培養菌經ITS測序鑒定結果相符。進一步對calmodulin基因測序，發現為球形孢子絲菌；結合糖同化實驗鑒定，最終證實為球形孢子絲菌。3株菌株體外藥敏試驗顯示在菌絲相和酵母相時特比萘芬、伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)分別為0.125 μg/mL、1 μg/mL 和0.5 μg/mL；藥敏試驗提示其對特比萘芬敏感。患者服藥期間均無任何不良反應。復診時見患者皮損明顯好轉(圖4a、b)。提示病變組織的早期分子檢測可以早期診斷，指導治療。

a：病例1治療1個月后復診：左手背皮損大小較治療前好轉；b：病例2治療1個月左右復診：右手背皮損大小較治療前縮小

圖4 抗真菌治療后患者臨床圖像

3 討論

孢子絲菌病主要分布在熱帶和亞熱帶國家，也可以發生在溫帶國家，好發于農林畜牧業人群。是皮膚科最常見感染性肉芽腫性疾病之一，也是最常見的皮下組織真菌病[1-3]。典型皮損表現為糜爛、潰瘍、浸潤斑塊或結節；當感染孢子絲菌時由于宿主免疫力不同、皮損及發病部位不同、長期搔抓、自行外用不明藥物等因素可出現不典型皮損。診斷金標準仍是培養陽性[5]。

對于深部真菌感染傳統診斷方法主要包括鏡檢、培養及組織病理學檢查；直接鏡檢陽性率低，使用培養基進行鑒定菌種耗時長，至少需要1～2周，給臨床診治帶來不便；組織病理學檢查不容易找到典型的真菌孢子，且不能準確鑒定致病菌種[6]。而病變組織的直接分子鑒定能提早明確致病菌種并為經驗性治療用藥提供依據。本文3例患者由于鏡檢取膿液行直接鏡檢，見少量孢子，組織及膿液的培養需耗時1周；然而采用病變組織直接提取DNA鑒定在2天內即可完成，大大縮短了臨床診療的進程。

雖然分子診斷可以給臨床診治帶來便捷，但是目前孢子絲菌病診斷的金標準仍是培養陽性，而且致病真菌對藥物敏感性的檢測也只能對培養獲得的純菌進行。因此，對培養菌株的分子生物學和形態學鑒定結果仍是必要的，可與早期診斷獲得的結果相互驗證。

臨床治療中，飽和碘化鉀溶液為治療孢子絲菌病的經典藥物，但其潛在的副作用(如碘疹、胃腸道紊亂、甲狀腺抑制等)以及配制不方便等原因限制了臨床使用[11]；根據美國感染疾病學會發表的孢子絲菌病診療指南推薦伊曲康唑為治療孢子絲菌病的首選藥物，其次為特比萘芬[12]；該3例球形孢子絲菌經驗性給予了特比萘芬口服250 mg/d治療；藥敏檢測時結果也提示菌株對特比萘芬敏感；經隨訪，3例患者均獲得治愈。