熒光染色法和KOH濕片法、真菌培養(yǎng)法在皮膚淺部真菌感染診斷中的應(yīng)用比較

杜 鵬 黃嘉怡 沈守星 魏秋姣 劉小鳳

淺部皮膚真菌病是由真菌侵犯表皮、毛發(fā)和甲引起的傳染性皮膚病，包括頭癬、手足癬、體股癬、甲真菌病和花斑糠疹等。以往臨床常用檢測方法為10% KOH濕片法以及真菌培養(yǎng)法。KOH濕片法雖然簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，但由于背景雜亂、檢出率低，對檢驗人員技術(shù)水平要求較高；真菌培養(yǎng)法特異性高同時可以進(jìn)行菌種鑒定，指導(dǎo)臨床用藥，但陽性率低、耗時長。近來，熒光染色劑calcofluor white(CFW)在真菌感染的診斷中應(yīng)用越來越廣。筆者對疑似淺部皮膚真菌感染的臨床標(biāo)本同時進(jìn)行KOH濕片法、真菌培養(yǎng)法以及CFW熒光染色法檢測，以評估CFW熒光染色法的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取來自珠海市慢性病防治中心皮膚門診的疑似淺部皮膚真菌感染的病人236 例，其中男104例，女132 例。皮屑標(biāo)本179例，毛發(fā)標(biāo)本5例，甲屑標(biāo)本52例，所有標(biāo)本同時采用KOH濕片法、真菌培養(yǎng)法以及CFW熒光染色法進(jìn)行檢測。

1.2 方法

1.2.1 取材 ①皮屑：先用75%的酒精消毒患者皮損部位，再用鈍頭刀片刮取皮屑，毛囊炎取毛囊內(nèi)容物，有水(膿)皰時取皰液；②毛發(fā)：先用75%的酒精消毒患者皮損部位，再用鑷子拔取毛發(fā)置于載玻片上;③指趾甲：先用75%的酒精消毒，再用尖頭刀片刮取甲下甲屑。所有標(biāo)本平均分為3份。

1.2.2 KOH濕片法 將適量樣本置于載玻片上，滴加一滴KOH溶液，蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上方快速通過2～3次，注意不要沸騰，輕壓蓋玻片，用棉簽吸去多余的溶液，顯微鏡下觀察。

1.2.3 真菌培養(yǎng)與鑒定 將適量標(biāo)本接種于含50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放線菌酮的SDA上，置26℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3周。馬拉色菌接種于含菜籽油沙氏培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2周。觀察菌落形態(tài)特征以及顯微鏡下觀察菌絲和孢子特征，念珠菌接種于念珠菌顯色培養(yǎng)皿進(jìn)行鑒定。

1.2.4 CFW熒光染色法 將適量標(biāo)本置于載玻片上，滴加一滴熒光染色液，蓋上蓋玻片，輕壓，用棉簽吸去多余的染色液。置于Olympus CX23熒光顯微鏡下觀察，高倍鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料使用卡方檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同感染部位樣本熒光顯微鏡鏡下形態(tài)學(xué)觀察 對236例樣本進(jìn)行了CFW熒光染色法檢查，菌絲及孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，在干凈的背景下，根據(jù)典型的菌絲橫隔和孢子出芽結(jié)構(gòu)，易于識別(圖1～6)。

2.2 三種檢查方法的比較 236例患者中，皮屑標(biāo)本179例，其中體股癬最多，手足癬次之。甲癬的甲屑標(biāo)本52例，頭癬的毛發(fā)標(biāo)本5例。CFW熒光染色法檢出陽性標(biāo)本214例(90.6%)，KOH濕片法檢出陽性標(biāo)本 159 例(67.4%)，真菌培養(yǎng)法檢出陽性標(biāo)本142例(60.2%)。CFW熒光染色法檢出率明顯高于KOH濕片鏡檢法(χ2=38.67，P<0.01)，也高于真菌培養(yǎng)法 (χ2=59.25，P<0.01)，KOH濕片鏡檢法與真菌培養(yǎng)法無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=2.65，P=0.1)。由同一組織樣本三種檢查方法的陽性率對比可見，除脂溢性皮炎和毛囊炎外，甲屑中CFW熒光染色法的陽性率明顯高于其他兩種方法(χ2=9.18，P=0.002；χ2=74.47，P<0.001)。見表1。

圖1 足癬皮屑見大量有隔細(xì)長菌絲 (熒光染色，×400)圖2 股癬皮屑見有隔細(xì)長菌絲(熒光染色，×400)圖3 甲真菌病甲屑見大量有隔菌絲 (熒光染色，×400)

圖4 馬拉色菌毛囊炎皮屑見大量未出芽孢子(熒光染色，×400)圖5 頭癬毛發(fā)見大量發(fā)內(nèi)菌絲(熒光染色，×400)

圖6 花斑糠疹見大量弧形菌絲和孢子(熒光染色，×400)

表1 CFW熒光染色法和KOH濕片法、真菌培養(yǎng)法的應(yīng)用比較

3 討論

淺部皮膚真菌感染的診斷主要依賴于臨床標(biāo)本的真菌直接鏡檢和培養(yǎng)[1]，但這兩種方法存在各自弊端：真菌直接鏡檢時常因標(biāo)本中雜質(zhì)多而導(dǎo)致背景雜亂，尤其是甲屑標(biāo)本，易把細(xì)胞壁、纖維誤認(rèn)為菌絲[2,3]，把氣泡和油滴誤認(rèn)為孢子，同時易漏檢散在的菌絲或孢子，鏡檢結(jié)果個人主觀性較大；真菌培養(yǎng)結(jié)果與皮屑采集的質(zhì)量、數(shù)量及患者的近期用藥情況息息相關(guān)，而且耗時長[3]。熒光染色法通過特殊熒光素與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)產(chǎn)生高效、特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡紫外光(波長340～380 nm)或者藍(lán)紫光(波長420～490 nm)特定的激發(fā)光波段下，菌絲或者孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，在背景下易于分辨。同時，由于熒光染液中含有KOH成分，一方面可以溶解組織細(xì)胞，使組織透明化，另一方面，還可以去除背景中的干擾熒光，提高與背景的反差。

我們共收集236例疑似淺部皮膚真菌病患者的標(biāo)本，其中CFW熒光染色法檢出陽性標(biāo)本214例(90.6%)、KOH濕片法共檢出陽性標(biāo)本 159例(67.4%)、真菌培養(yǎng)法共檢出陽性標(biāo)本142例(60.2%)。CFW熒光染色法檢出率明顯高于 KOH濕片法與真菌培養(yǎng)法。我們對標(biāo)本進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)分，按檢測樣本類型分為皮屑(179份)、毛發(fā)(5份)和甲屑(52份)。皮屑檢查中CFW熒光染色法陽性165例(92.1%)，KOH濕片法陽性124例(69.3%)，真菌培養(yǎng)陽性115例(64.2%)，CFW熒光染色法與其它兩種檢查陽性率有顯著性差異(χ2=30.18,P<0.01；χ2=40.98,P<0.01)，其它兩種方法無顯著性差異(χ2=1.02,P>0.05)。毛發(fā)樣本主要來自頭癬患者，這三種方法檢查的陽性率相差無幾。甲真菌病一直是實(shí)驗室真菌檢測的難點(diǎn)，由于甲屑材質(zhì)厚，背景雜亂，特別容易出現(xiàn)假陰性，對實(shí)驗室檢測人員的能力提出更高的要求，本研究中CFW熒光染色法陽性率為75%，KOH濕片鏡檢陽性率為57.7%，我科室真菌培養(yǎng)陽性率為44.2%，CFW熒光染色法的陽性率明顯高于其他兩種方法(χ2=9.18，P=0.002；χ2=74.47，P<0.001)，無論是在檢測能力還是在具體的檢測過程中，CFW熒光染色最值得在甲真菌的診斷中推廣。由于標(biāo)本的類型以及來源的不同，三種檢測方法的陽性率與其它研究無可比性，但CFW熒光染色法優(yōu)于KOH濕片法、真菌培養(yǎng)法的結(jié)論與其它研究相同[4-7]。

CFW熒光染色法在疑難標(biāo)本例如外涂膏藥標(biāo)本、色減型花斑糠疹皮屑、用藥后復(fù)診標(biāo)本，尤其是在甲屑標(biāo)本的檢查中具有明顯優(yōu)勢，也彌補(bǔ)了新手工作經(jīng)驗不足的缺點(diǎn)，有效降低了假陰性率。由于CFW熒光染色液可將纖維著色，從而發(fā)出熒光，但纖維在形態(tài)、大小、粗細(xì)、結(jié)構(gòu)方面與菌絲具有很大差異，一般都可以分辨出。熒光染色費(fèi)用的高昂限制了其在臨床的大規(guī)模應(yīng)用，另外，CFW熒光染色液存在熒光淬滅現(xiàn)象，在使用一段時間后出現(xiàn)熒光強(qiáng)度降低現(xiàn)象，應(yīng)注意避光保存。總而言之，熒光染色法具有簡單、快速、耗時短、結(jié)果直接的優(yōu)點(diǎn)，與KOH濕片法與真菌培養(yǎng)法相結(jié)合，可以進(jìn)一步提高真菌檢查的陽性率，值得在臨床推廣。