沙雷氏蛋白酶及其專一性抑制劑的研究進展

張琳桓，孫謐，王偉，孫晶晶，劉均忠，郝建華,3*

1(農業農村部極地漁業開發重點實驗室，中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島，266071)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)3(江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港，222005)

1 沙雷氏蛋白酶

1.1 蛋白酶

蛋白酶(protease)是生物體內通過切斷蛋白質肽鍵從而水解蛋白質的一類酶的總稱，控制著蛋白質的大小、組成、空間構象及其最終降解。生物體內的生理活動和疾病的發生與蛋白酶息息相關，如食物的消化吸收，血液的凝固、溶血作用、消炎、血壓調節、細胞分化自溶、機體衰老、癌癥轉移以及生理活性肽的活化等。

蛋白酶來源廣泛，初期來源于動物和植物，但這兩者所分泌的均為胞內酶，生產耗時耗力，故工業上一般利用微生物進行大規模生產胞外蛋白酶。蛋白酶是目前在全世界產量占比百分之四十且廣泛應用的商品酶(主要應用在食品、制革、日化和醫藥行業等)[1]。

按照國際生物化學和分子生物學聯合會(IUBMB)命名委員會規定的命名法，蛋白酶隸屬于水解酶類的第4亞類，然而，由于自身作用和結構多樣性，蛋白酶的命名很難與通用命名系統一致[2]。按照最適作用的pH值，蛋白酶可分類為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[3]。按其水解多肽的方式，可將蛋白酶歸類為外肽酶和內肽酶兩類[4]：外肽酶是從蛋白質分子的游離氨基或羧基末端逐個水解多肽鏈，從氨基端水解的為氨基肽酶，從羧基端水解的為羧基肽酶；內肽酶則是專一性地把蛋白質多肽鏈從分子內部切斷，形成小分子量的朊和胨。工業生產用的蛋白酶主要為內肽酶。按催化中心的種類可分為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶[5]。其中，金屬蛋白酶主要是鋅金屬蛋白酶[6]，跟據鋅離子的結合位點又可將鋅金屬蛋白酶分為五類：嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、沙雷氏蛋白酶(serralysin)、龍蝦肽酶(astacin)、基質金屬蛋白酶(matrixin，metalloproteinase MMP)以及蛇毒金屬蛋白酶(adamalysin)[7]。HOOPER[8]對此分類進行擴充，將嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)與其他擁有谷氨酸配位的蛋白酶合并為谷氨酸鋅蛋白(gluzincin)，相應的，將剩余后四類合并為甲硫氨酸鋅蛋白(metzincin)。

1.2 沙雷氏蛋白酶

沙雷氏蛋白酶屬于鋅金屬蛋白酶M10B亞家族(http://merops.sanger.ac.uk/)，是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的胞外內肽酶，多存在于沙雷氏菌、菊歐文氏菌、弗氏埃希氏菌和銅綠假單胞菌中[9]。

1.2.1 沙雷氏蛋白酶的活性中心

鋅金屬蛋白酶的活性中心是由Zn2+構成，其作用是活化水分子，使水分子親核攻擊肽鍵的羰基。N段有一段保守序列HEXXH(His-Glu-Xaa-Xaa-His，斜體表示配位體)，包含2個組氨酸配位體和1個作為一般堿基的谷氨酸[10]。甲硫氨酸鋅蛋白保守區序列延長為HEXXHXXGXXH，提供了3個組氨酸配體與Zn2+結合。HEXXH基序位于1個α-螺旋上，第三配位體在另1個α-螺旋上，而配位體要在空間上縮進距離，必然要有一個轉角[11]。因此，β-轉角使3個金屬配體在空間上相互靠近，也是活性位點形成的基礎[12]。在β-轉角區域是否存在1個保守的甲硫氨酸，是判斷蛋白酶是否屬于甲硫氨酸鋅蛋白的依據，故又稱“甲硫氨酸轉角”[13]。對于沙雷氏蛋白酶來說，鋅配位保守序列是HEXXHXXGXXHP，在第12位上是1個脯氨酸，甲硫氨酸轉角的保守序列是SBMSY，酪氨酸是一般堿基[14]。

孫謐[15-16]等發現了由海洋細菌YS-80-122分泌的胞外海洋低溫蛋白酶MP，對其進行了基因測序和晶體結晶。研究表明MP存在2個結構域：N-端結構域是蛋白水解結構域，含有活性位點；C端結構域主要和蛋白穩定性有關，含平行β-卷結構和7個結合的Ca2+。其N-端保守序列為HEXXHXXGXXHP，其中His186、His190、His196、Tyr226以及水分子是Zn2+的配體，形成了三角雙錐結構，符合沙雷氏蛋白酶特征。除此之外，MP的N端部分氨基酸序列為ANGTSSAFTQ，與來自假單胞菌屬TAC II 18的沙雷氏蛋白酶的氨基酸序列相同，證明其確實屬于沙雷氏金屬蛋白酶[17]。

1.2.2 沙雷氏蛋白酶性質

沙雷氏蛋白酶是胞外酶，可水解酪蛋白，被EDTA和鄰菲咯啉抑制。

KWAK[18]等發現了沙雷氏菌(Escratiaproteamaculans)HY-3產生的屬于沙雷氏蛋白酶的胞外酶arazyme，可有效地水解許多蛋白質底物，包括白蛋白，角蛋白和膠原蛋白等。酶的蛋白水解活性不被天冬氨酸，半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制，但是被1,10-菲咯啉和EDTA強烈抑制。

熒光假單胞菌KT1可以分泌一種細胞外金屬蛋白酶，分子量47～48 kDa，部分氨基酸序列分析顯示該酶與沙雷氏蛋白酶高度同源。該酶被螯合劑如EDTA和鄰菲咯啉強烈抑制，并被某些表面活性劑活化[19]。

1.2.3 沙雷氏蛋白酶的應用及危害

沙雷氏蛋白酶的水解能力和對應產生的致病效果，使其擁有了應用價值。KIM[20]等用幾丁質誘導一種新型沙雷氏菌屬細菌KCK得到的沙雷氏蛋白酶Mpr，可以通過預處理幾丁質來促進幾丁質酶A對幾丁質的降解。通過生物化學和分子生物學方法從粘質沙雷氏菌FS14中分離鑒定出一種具有獨特V型熱穩定性的沙雷氏蛋白酶SPB(Serralysin-like protease B，SPB)，在60 ℃時具有自溶性質，對棉鈴蟲幼蟲具有毒性，在昆蟲控制中具有潛在的應用[21]。

沙雷氏蛋白酶在細菌生理學中的功能被認為是水解周圍環境中的蛋白質底物，為細菌細胞提供簡單的營養[22]。奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)在游動細胞分化過程中產生許多毒素，其中包括胞外金屬蛋白酶ZapA(也稱為Mirabilysin)，該蛋白酶屬于沙雷氏蛋白酶。ZapA在感染部位分泌，破壞組織和宿主的免疫系統[23]。SlpE是與粘質沙雷氏菌屬臨床分離株相關的鈣依賴性細胞毒性金屬蛋白酶，并且有證據表明SlpE導致沙雷氏菌對A549氣道癌細胞系的毒性[24]。郝俊[25]用PCR方法和電子顯微鏡觀察的方法驗證了柑橘黃龍病病原中進攻性的I型分泌蛋白(COG2931)的基因屬于沙雷氏蛋白酶，并探究了其對黃龍病的致病機理。

2 沙雷氏蛋白酶抑制劑

2.1 蛋白酶抑制劑

蛋白酶抑制劑是一類在動植物和微生物體內普遍存在且分子量很小的有環狀結構的蛋白質，可競爭性或非競爭性抑制蛋白酶水解活性，在調節涉及組織蛋白動員和蛋白質前體加工的各種生理和病理過程中起關鍵作用，還可間接使病毒顆粒無法成熟，抑制病毒的復制。因此，許多致病蛋白酶的抑制劑是有效的抗病藥物。

不同類型的抑制劑其活性和作用靶酶不同，不同來源的抑制劑其性質和藥理作用也各不相同，這又增加了此類藥物臨床療效的選擇性。進一步研究蛋白酶抑制劑可以提供無毒無污染的生物農藥，還可開發成更具特色的新型藥物[26]。

2.2 沙雷氏蛋白酶抑制劑

能抑制沙雷氏蛋白酶的抑制劑有很多種類，包括螯合劑如EDTA和鄰菲咯啉，但本文描述的抑制劑是特指從屬于沙雷氏蛋白酶的抑制劑，專一性抑制沙雷氏蛋白酶。在對產沙雷氏蛋白酶的微生物進行基因組分析發現：這類蛋白酶基因附近都有一段抑制其酶活性的抑制劑基因，與蛋白酶基因在基因組序列中處于緊鄰的位置，屬于同一個分泌體[27]。該抑制劑基因編碼的蛋白即為沙雷氏蛋白酶抑制劑，是一種小分子蛋白質。

沙雷氏蛋白酶抑制劑具有相當的生物學價值，因為它們涉及在許多情況下調節鋅金屬蛋白酶活性，包括假單胞菌感染、腫瘤轉移和自身免疫性疾病中對組織的破壞[28]。雖然蛋白酶抑制劑具有良好的發展潛力，但是只有少數報道描述了沙雷氏蛋白酶抑制劑的特征，至于沙雷氏蛋白酶和對應抑制劑的復合物，至今為止僅有4種被綜述。

2.2.1 沙雷氏蛋白酶抑制劑的性質

沙雷氏蛋白酶抑制劑穩定性較強，熱處理后大多可恢復抑制活性，分子量約為10 kDa。ODA[29]等從黑色鏈霉菌TK-23的培養濾液中分離出能夠抑制金屬蛋白酶活性的新型金屬蛋白酶抑制劑。pH 2～7條件下100 ℃處理5 min后，抑制劑保留其原始活性的80%。分子量為12 kDa，等電點為10.3。該抑制劑顯示出高含量的疏水性氨基酸，不含色氨酸，并具有2個二硫鍵。

LIANG[30]等從海洋細菌黃桿菌sp.YS-80-122克隆了1種新的沙雷氏抑制基因lupI，在高溫下是耐熱的。沙雷氏金屬蛋白酶抑制劑SmaPI的等電點約為10.0，是分子量為10 kDa的單體蛋白質。該抑制劑在沸水中穩定長達30 min，其熱穩定性是由于其可逆變性[31]。

2.2.2 沙雷氏蛋白酶抑制劑的作用

沙雷氏蛋白酶抑制劑具有相當的生物學價值，可以治療沙雷氏蛋白酶誘發的疾病[32-33]。沙雷氏蛋白酶可不同程度的加重腦膜炎、心內膜炎、腎炎、鼠疫、皮炎、軟組織感染、敗血癥、類鼻疽、肺炎以及其他呼吸道和尿道感染等人類疾病，甚至進一步引起菌血癥和各種全身感染，特別是對免疫低下的癌癥和艾滋病患者尤為嚴重。在醫院感染中，主要造成手術傷口感染和新生兒感染。這種威脅被抗生素耐藥菌株的出現所擴大，并且增加了對新型治療方法的需求。除人類外，這些病原體還可能感染其他生物，脊椎動物和無脊椎動物。例如，銅綠假單胞菌和粘質沙雷氏菌都能夠通過基于毒素的機制或通過感染殺死線蟲。銅綠假單胞菌還可能攻擊植物也可在馬中造成鼻疽。沙雷氏蛋白酶的危害程度由特定的約10 kDa內源性抑制劑(即沙雷氏蛋白酶抑制劑)所控制。這些抑制劑由相同的蛋白酶分泌物編碼，并進一步提供約25個殘基的分泌信號肽。推測其生理功能是保護細菌周質空間從而保證其免受蛋白酶的影響[34]。

CARSON[35]等通過繪制蛋白酶的S10結合位點，試圖找到蛋白酶與蛋白酶抑制劑結合的喜好與差異。在2個原始金屬蛋白酶抑制劑(1個嗜熱蛋白酶抑制劑和1個沙雷氏蛋白酶抑制劑)的基礎上，對抑制劑類似物的設計、合成和篩選進行了研究。驗證了可以開發有效地抑制沙雷氏蛋白酶的廣譜沙雷氏蛋白酶抑制劑的可能性。

植物不可避免地受到各種有害生物和病原體的侵襲，造成作物產量的整體損失。由于缺乏特異性，長期使用化學農藥會使病菌產生抗性，污染環境，具有嚴重的缺陷。因此，可降低抗性發展并且可生物降解的生物防治劑是有利的替代品。蛋白酶抑制劑具有調節蛋白酶的作用，在保護植物免受有害生物和病原體入侵中起重要作用[36]。

3 沙雷氏蛋白酶與抑制劑復合物

3.1 沙雷氏蛋白酶與抑制劑復合的結構

沙雷氏蛋白酶抑制劑對蛋白酶活性位點的抑制通常通過抑制劑的暴露結構元件(如單個環或蛋白質末端)獨立地或以2種及以上元件與蛋白酶活性位點對接來實現。通常來說，抑制劑的反應位點和蛋白酶的活性中心是互補的[37]。例如利用N-端殘基與Zn2+的配位鍵，N-端Trunk結構的長度保證了N-端殘基和鋅離子之間精確和密切的相互作用(如圖1所示)。

a-Serratia marcescens的蛋白酶SMP與Erwinia chrysanthemi的沙雷氏蛋白酶抑制劑Inh的復合體結構；b-APR與抑制劑APRin的復合物的晶體結構(1JIW)圖1 沙雷氏蛋白酶與其抑制劑復合物三維結構圖Fig.1 Three-dimensional structure diagram of Serralysin and its inhibitor complex

3.2 四種沙雷氏蛋白酶與抑制劑復合物實例

3.2.1 蛋白酶APR與其抑制劑APRin

來自銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的1種堿性蛋白酶APR和抑制劑APRin是一組典型的沙雷氏蛋白酶與抑制劑。蛋白酶抑制劑APRin是由幾種革蘭氏陰性細菌分泌的，具有高親和性，分子量為11.5 kDa[38]。

蛋白酶APR和抑制劑APRin復合物的晶體衍射結構分析顯示，有兩個空間上的接觸：一個是抑制劑β-折疊IV和V之間的loop環，它與蛋白酶的甲硫氨酸轉角相互接觸；另一個是N-端5個殘基構成的Trunk結構，約成直線狀伸入蛋白酶的β-桶結構，占據了酶的活性中心，阻止其他多肽底物進入酶的活性中心，末端氨基基團(Ser)與酶的催化鋅配位，從而抑制該蛋白酶的活性[39]。

3.2.2 蛋白酶SMP與其抑制劑SmaPI

沙雷氏金屬蛋白酶抑制劑(SmaPI)是沙雷氏金屬蛋白酶(SMP)的抑制劑。前體抑制劑通過切割信號肽(26個氨基酸殘基)產生SmaPI。該抑制劑具有可逆變性，可在沸水中穩定長達30 min。SmaPI以摩爾比1∶1的比例抑制SMP形成非共價復合物，顯示出高蛋白酶特異性，在檢測的各種蛋白酶中僅抑制SMP[31]。

LéTOFFé[40]等從365株粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中克隆了SMP基因，并從攜帶重組質粒的大腸桿菌轉化體中檢測出針對SMP的抑制活性。他們認為SmaPI的抑制活性是保護細胞免受SMP蛋白水解損傷所必需的。在SmaPI的N-端區域的連續缺失分析中， SmaPI基本能全面抑制SMP活性。Leu-3與SMP的相互作用對SMP-SmaPI復合物(8.44 kcal/mol)的整體穩定性貢獻0.73 kcal/mol。通過對Leu-3定點突變，驗證了疏水的Leu-3在SMP與其抑制劑SamPI結合過程中起重要作用[41]。

3.2.3 多種蛋白酶與抑制劑Inh

菊歐文氏菌(Erwiniachrysanthemi)，1種植物病原菌，可產生沙雷氏蛋白酶抑制劑Inh。Inh是1種非常具有熱穩定的(95 ℃下t1/2>30 min)堿性蛋白，等電點約為8.5。抑制劑Inh在胞內被合成為12 kDa的蛋白，包括19個殘基的信號肽[42]。當抑制劑被分泌到細胞質中后，信號肽被切割，成熟抑制劑的分子量為10 kDa。像許多蛋白酶抑制劑一樣，它與蛋白酶以非共價鍵結合，形成1∶1的非共價復合物。

與SmaPI不同的是，Inh可以抑制不同的沙雷氏蛋白酶。除了對3種菊歐文氏胞外蛋白酶A、B和C有作用外，還強烈抑制來自沙雷氏菌的50 kDa細胞外蛋白酶SMP。BAUMANN[43]等對SMP和Inh的復合物進行晶體分析，發現Inh主要通過5個N末端殘基與蛋白酶相互作用，插入活性位點裂隙，占據S'位點。第1個N-末端殘基SerI1被蛋白酶切割，而SerI2與蛋白酶的谷氨酸Glu177形成氫鍵。蛋白酶中位于甲硫氨酸轉角之后的218～228片段與由鏈s3，s4和s5形成的抑制劑的一個面還會發生進一步的相互作用。

3.2.4 蛋白酶MP與其抑制劑LupI

來源于海洋細菌菌株YS-80-122的低溫蛋白酶MP基因下游有一個抑制劑基因LupI，該基因的表達產物LupI能在體外完全抑制蛋白酶MP的活性[44]。LupI對其靶金屬蛋白酶MP的抑制常數為0.64 μmol/ L；高溫下耐熱，在100 ℃下處理1～60 min后其抑制活性仍保留35.6%～90.7%。該新型抑制劑可代表用于治療沙雷氏蛋白酶相關感染的候選藥物[30]。

MP與LupI的結構雖然還沒有具體復合物晶體數據研究，但梁朋娟[45]等突變了抑制劑LupI的N-端Trunk結構，發現其抑制活性大大降低。結合結構模擬與分子對接，認為該抑制劑與蛋白酶的結合類似于蛋白酶APR和抑制劑APRin，N-端Trunk結構可以直接插入蛋白酶MP的活性中心，導致其失活。

4 結語

近年來，越來越多的學者對沙雷氏蛋白酶或者沙雷氏蛋白酶抑制劑進行研究，提取純化、基因測序、晶體解析等研究方法日趨成熟，但對于兩者結合的具體位點及結構的表述較少，僅有4種沙雷氏抑制劑及其對應蛋白酶復合物被詳細描述。沙雷氏蛋白酶在調節組織蛋白動員和蛋白質前體加工的各種生理和病理過程中起關鍵作用，尤其是對感染類疾病有著重要的作用。沙雷氏蛋白酶抑制劑作為特異性抑制可以只針對特定的靶蛋白酶進行抑制，并且不受抗生素耐藥菌株的抗藥性影響，因此可就此進行藥物的設計，以阻止沙雷氏蛋白酶的危害。進一步探究沙雷氏蛋白酶和其抑制劑的結合有助于利用沙雷氏抑制劑針對性治療沙雷氏蛋白酶相關疾病，在醫學、農業等方面均有巨大潛力。