β-葡萄糖苷酶對(duì)‘雙優(yōu)’干紅葡萄酒理化性質(zhì)和香氣物質(zhì)的影響

劉歡，李皓，陳長(zhǎng)武，何文兵

1(吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春,130052) 2(吉林省山葡萄資源開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，吉林 長(zhǎng)春，130052)3(通化師范學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 通化，134002)

山葡萄(VitisamurensisRupr)也稱(chēng)東北山葡萄，原產(chǎn)中國(guó)東北、華北及朝鮮、日本、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，是葡萄科葡萄屬落葉藤本植物。我國(guó)東北山葡萄資源主要分布于遼寧、吉林、黑龍江三省的長(zhǎng)白山和興安嶺山脈中，其中通化地區(qū)是東北葡萄產(chǎn)區(qū)的主要栽培以及酒的生產(chǎn)地[1]。目前，通化集安地區(qū)主要栽培‘雙紅’‘雙優(yōu)’‘公釀1號(hào)’和‘北冰紅’等品種。其中，‘雙優(yōu)’山葡萄是1963年吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)從‘雙慶’營(yíng)養(yǎng)系中選育而成，在通化集安地區(qū)栽培歷史有20年以上，葡萄的栽培和管理技術(shù)較為成熟。其漿果著生緊、粒小、圓形、紫黑色、皮薄、味酸甜和果香味濃郁。含糖量為110～130 g/L，含酸量為20～23 g/L，出汁率65%[2]。由于‘雙優(yōu)’山葡萄低糖、高酸，使其酒口感不佳，香氣濃郁性和復(fù)雜性降低。俗話(huà)說(shuō)“葡萄酒的質(zhì)量先天在于葡萄，后天在于工藝”，所以可以通過(guò)后天的工藝技術(shù)改善山葡萄酒品質(zhì)不足，同時(shí)強(qiáng)化它的特色。然而，多數(shù)研究主要針對(duì)山葡萄或山葡萄酒的有機(jī)酸、花色苷或香氣成分檢測(cè)等方面[3-4]，提高‘雙優(yōu)’山葡萄酒品質(zhì)技術(shù)的研究較少。

香氣成分是葡萄酒品質(zhì)的主要因素，構(gòu)成葡萄酒香氣的化合物復(fù)雜多樣，有幾百乃至上千種，主要有醇、酯、內(nèi)酯、縮醛、脂肪酸、單萜醇氧化物等1 300多種，這些氣味各異的物質(zhì)之間通過(guò)累加、協(xié)同、分離以及抑制等相互作用，使葡萄酒香氣千變?nèi)f化，多種多樣[5-6]。山葡萄香氣種類(lèi)也比較豐富，涂正順等[7]對(duì)‘雙優(yōu)’等品種的香氣成分進(jìn)行分析，‘雙優(yōu)’果實(shí)中有45種香味物質(zhì)，其主要含有乙酸乙酯、己酸乙酯、橙花醇乙酸酯等表現(xiàn)為果香的成分。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒香氣成分中糖苷香氣物質(zhì)則部分代表了葡萄品種的潛在香氣，在β-葡萄糖苷酶作用下，水解酯、醇、萜烯類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯和苯衍生物等糖苷類(lèi)前體物質(zhì)釋放出相應(yīng)的糖苷配基和糖類(lèi)，賦予葡萄酒香氣[8-9]。WANG等[10]研究3種不同β-葡萄糖苷酶對(duì)蛇龍珠葡萄酒香氣和花色苷的影響，研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶水解糖苷類(lèi)物質(zhì)前體和花色苷，酶處理后香氣成分顯著增加而花色苷含量略有降低，低pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶活性具有明顯抑制作用。RODRIGUEZ等[11]研究發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)內(nèi)和酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有水解β-葡萄糖苷酶水解糖苷類(lèi)物質(zhì)前體釋放香氣成分的作用，但水解作用受葡萄酒中高的糖、酒精度和酚類(lèi)物質(zhì)以及低pH值等發(fā)酵條件影響。

因此，本文以‘雙優(yōu)’山葡萄為原料發(fā)酵葡萄酒，研究β-葡萄糖苷酶對(duì)其品質(zhì)的影響。測(cè)定在發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活力變化以及發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒基本理化指標(biāo)和香氣成分，初步分析山葡萄酒對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響，進(jìn)一步探討β-葡萄糖苷酶對(duì)‘雙優(yōu)’山葡萄酒增香作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試葡萄品種為‘雙優(yōu)’山葡萄品種。本實(shí)驗(yàn)摘取吉林省通化市集安地區(qū)葡萄園(東經(jīng)125°34E，北緯40°52N)中成熟山葡萄，采摘時(shí)間為2015年9月25日。‘雙優(yōu)’山葡萄理化指標(biāo)為：?jiǎn)喂?.35 g，果實(shí)比重1.07 g/cm3，出汁率45.49%，白利度16 °Bx，總糖60.54 g/L，總酸14.67 g/L，總花色苷0.207 g/L。

1.1.2 試劑

葡萄糖、NaCl、酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、亞硫酸、檸檬酸、Na2CO3等為國(guó)產(chǎn)分析純；4-甲基-2-戊醇為色譜純，購(gòu)于上海一基實(shí)業(yè)有限公司；p-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。葡萄酒專(zhuān)用酵母菌(RV171菌株)購(gòu)于安琪酵母有限公司；β-葡萄糖苷酶為本實(shí)驗(yàn)室用黑曲霉菌株發(fā)酵獲得酶提取物(酶活力為10 U/g，最適溫度為50 ℃，最適pH值為5.0)。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E型分析天平，梅特勒 托利多國(guó)際股份有限公司；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；TRACE1300/ISQ-LT型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；PC-420D型固相微萃取(SPME)，美國(guó)色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀制工藝

(1)挑選、清洗、破碎和除梗：選取‘雙優(yōu)’，完全成熟的、新鮮的、無(wú)機(jī)械損傷的、無(wú)病蟲(chóng)害的山葡萄；采用破碎-除梗機(jī)去除果梗并機(jī)械破碎，將破碎山葡萄汁裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝入量為發(fā)酵罐體積的70%～80%，發(fā)酵罐體積為5 L；同時(shí)，將體積分?jǐn)?shù)為5%亞硫酸加入到山葡萄汁中，使其含量達(dá)0.05 g/L SO2。(2)接種：將0.1%葡萄酒專(zhuān)用干釀酒酵母活化，接種到山葡萄汁中，接種量為1.0×106CFU/mL，充分?jǐn)嚢琛?3)加酶增香：將β-葡萄糖苷酶以100 U/L(以山葡萄汁體積計(jì))加入至山葡萄汁中，充分?jǐn)嚢瑁晕醇尤毽?葡萄糖苷酶的山葡萄酒為對(duì)照。(4)發(fā)酵：封閉發(fā)酵，每天早晚2次開(kāi)封充分?jǐn)嚢瑁瑪嚢钑r(shí)使上浮葡萄皮下沉，充分浸漬；浸漬時(shí)間7 d后，將山葡萄皮、籽與山葡萄汁分離。(5)澄清：分離山葡萄酒再用0.4 g/L膨潤(rùn)土處理，澄清并穩(wěn)定山葡萄酒，每3 d處理1次，共處理2次，獲得澄清山葡萄酒。(6)陳釀：發(fā)酵罐密封陳釀增香5 d，陳釀溫度為(18±2) ℃。(7)中止發(fā)酵：補(bǔ)加0.05 g/L SO2停止發(fā)酵。(8)取樣：每個(gè)處理分別用3個(gè)平行發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，每2 d取1次樣品，每次分別從3個(gè)平行發(fā)酵罐中取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2β-葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定

β-葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定采用pNPG法檢測(cè)，測(cè)定‘雙優(yōu)’山葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中每1天酶活。將1 mL樣品與1.25 mL 1 mmol/L的pNPG和3.75 mL檸檬酸-磷酸緩沖液(pH值5.0)混合液反應(yīng)30 min，然后加入5 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。反應(yīng)后樣品在400 nm下測(cè)定吸光度，即為產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(pNP)濃度。β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為：40 ℃條件下1 min內(nèi)催化生成1 μmol pNPG所需要的酶量。

1.3.3 葡萄酒理化指標(biāo)的測(cè)定

分別測(cè)定‘雙優(yōu)’山葡萄汁、中止發(fā)酵后對(duì)照和酶處理山葡萄酒樣品的理化指標(biāo)，測(cè)定方法：(1)可滴定酸采用電位滴定法，用酒石酸(g/L)計(jì)。(2)總糖采用斐林試劑熱滴定法測(cè)定，以葡萄糖(g/L)計(jì)。(3)總花色苷采用pH示差法，以花色苷(g/L)計(jì)。(4)色度采用色度分析，依據(jù)1976年CIEL*、a*、b*色度標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定450、520、630 nm波長(zhǎng)處的吸光度，依據(jù)4個(gè)吸光度計(jì)算L*、a*、b*數(shù)值。

1.3.4 頂空固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)提取香氣成分

分別取8 mL‘雙優(yōu)’山葡萄汁、中止發(fā)酵后對(duì)照和酶處理的山葡萄酒樣品加入到15 mL萃取瓶中，加入0.8 g NaCl穩(wěn)定樣品，再加入30 μL質(zhì)量濃度為3.2 g/L 4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)物，在45 ℃下預(yù)處理10 min，再用萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)在45 ℃下萃取30 min。

1.3.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)測(cè)定香氣成分

(1)色譜條件：色譜柱為30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管色譜柱(賽默飛公司，HP-5，弱極性柱子)；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，熱解析時(shí)間為8 min；載氣流速為1 mL/min；不分流進(jìn)樣；柱室程序升溫為初始柱溫32℃、保持3 min，以2 ℃/min速率升至50 ℃、保持2 min，再以4 ℃/min升至230 ℃、保持8 min。

(2)質(zhì)譜條件：MSD檢測(cè)器；電子轟擊(EI)離子源；質(zhì)量掃描范圍：m/z(30～450)；離子源溫度230 ℃；傳輸線(xiàn)溫度280 ℃。

(3)GC-MS分析：樣品的香氣成分經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)得各物質(zhì)的色譜峰后，將上述的各色譜峰所對(duì)應(yīng)化合物的名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式與2014年NIST譜圖進(jìn)行檢索和比對(duì)，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，鑒定和分析。采用內(nèi)標(biāo)半定量法計(jì)算香氣成分含量，按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：ai為待測(cè)物的峰面積；as為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Xi為待測(cè)物的含量，mg/L；Xs為內(nèi)標(biāo)物的含量，mg/L。

1.3.6 香氣活性值(odour activity values，OAVs)

OAVs是衡量葡萄酒典型香氣重要指標(biāo)，它是根據(jù)文獻(xiàn)查找每個(gè)香氣物質(zhì)在9.5%～14%乙醇溶液中的閾值(mg/L)，再根據(jù)香氣物質(zhì)的閾值和樣品中含量計(jì)算每個(gè)物質(zhì)的OAVs，以此表征某種香氣化合物對(duì)香氣貢獻(xiàn)的大小。一般認(rèn)為香氣物質(zhì)OAVs>1時(shí)，對(duì)葡萄酒典型香氣具有顯著的貢獻(xiàn)，而在1以下說(shuō)明嗅覺(jué)器官對(duì)這種物質(zhì)的氣味無(wú)感覺(jué)，某香氣物質(zhì)的OAVs越大，說(shuō)明對(duì)葡萄酒整體香氣的貢獻(xiàn)度也越大[12-13]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶活力變化

‘雙優(yōu)’山葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)照和添加β-葡萄糖苷酶山葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活力變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，‘雙優(yōu)’山葡萄汁中β-葡萄糖苷酶活力

為2.21 U/L，說(shuō)明‘雙優(yōu)’山葡萄汁中含有少量的β-葡萄糖苷酶[14]。添加100 U/L(以山葡萄汁體積計(jì))β-葡萄糖苷酶的山葡萄汁酶活力僅為46.45 U/L，說(shuō)明‘雙優(yōu)’山葡萄汁環(huán)境降低β-葡萄糖苷酶活力，一些研究也證明部分菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中活力會(huì)大大降低[15]。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組山葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活力先增加后減少；在發(fā)酵4～10 d酶活力變化較穩(wěn)定，在發(fā)酵第6天達(dá)到最大值12.46 U/L，隨后平緩降低；說(shuō)明山葡萄酒中存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，使β-葡萄糖苷酶活力增加。在酶處理山葡萄酒中，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)酶活力迅速增加，在發(fā)酵第7天酶活力達(dá)到最大值為72.42 U/L，一方面，微生物代謝產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶使其活力增加。另一方面，可能是由于β-葡萄糖苷酶逐漸適應(yīng)山葡萄酒發(fā)酵環(huán)境，對(duì)山葡萄酒低酸環(huán)境有了一定耐受性，恢復(fù)部分酶活力。隨后酶處理山葡萄酒的酶活力迅速降低，到第14天后酶活力降低趨于平緩，因?yàn)棣?葡萄糖苷酶水解山葡萄酒中糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)產(chǎn)生游離香氣物質(zhì)而被消耗，同時(shí)也可能是產(chǎn)物對(duì)酶活性具有抑制作用，使酶活力降低。

圖1 在葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活力的變化Fig.1 Changes of β-glycosidase activities in wines

2.2 山葡萄酒理化特性

‘雙優(yōu)’山葡萄汁以及發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)照組和添加β-葡萄糖苷酶山葡萄酒處理組理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 理化指標(biāo)結(jié)果Table 1 The results of physicochemical indexes

注：同一行不同字母表示顯著性差異(p<0.05，n=3);“NA”表示未檢測(cè)出成分。

由表1可知，‘雙優(yōu)’山葡萄汁總糖和總花色苷含量顯著高于山葡萄酒，而山葡萄酒酒精度顯著增加；可滴定酸降低不明顯。‘雙優(yōu)’山葡萄汁L*值和a*值低于山葡萄酒，說(shuō)明山葡萄汁經(jīng)菌株發(fā)酵后成分和顏色發(fā)生了顯著變化。比較對(duì)照和酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒理化特性可知，對(duì)照組總糖含量和酒精度顯著低于酶處理(p<0.05)，可能是β-葡萄糖苷酶水解山葡萄酒中糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)產(chǎn)生游離香氣物質(zhì)，同時(shí)釋放出糖類(lèi)，糖類(lèi)進(jìn)一步代謝生成醇。對(duì)照組總花色苷含量顯著高于酶處理組(p<0.05)，β-葡萄糖苷酶對(duì)總花色苷具有水解作用[10]。對(duì)照和酶處理組的可滴定酸和顏色無(wú)明顯差異(p>0.05)。

2.3 山葡萄酒香氣成分分析

對(duì)‘雙優(yōu)’山葡萄汁、加入β-葡萄糖苷酶和對(duì)照的‘雙優(yōu)’山葡萄酒香氣進(jìn)行定性和半定時(shí)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，共檢測(cè)和鑒定出54種香氣物質(zhì)，包括酯類(lèi)28種、醇類(lèi)8種、酸類(lèi)4種、酮類(lèi)3種、醛類(lèi)5種、揮發(fā)性酚類(lèi)1種、單萜烯類(lèi)2種、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)1種和苯衍生物類(lèi)2種，山葡萄汁、對(duì)照和酶處理組種類(lèi)分別為24、50和54種；酶處理組香氣物質(zhì)總量顯著高于對(duì)照和山葡萄汁處理組(p<0.05)，山葡萄汁、對(duì)照和酶處理組的香氣物質(zhì)總量分別為76.18、124.28和184.99 mg/L。由圖2可知，酯類(lèi)含量最高，其他類(lèi)別依次為醇類(lèi)、苯衍生物類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)、揮發(fā)性酚類(lèi)和單萜烯類(lèi)。每類(lèi)香氣物質(zhì)酶處理組含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，對(duì)照與酶處理組之間大部分香氣物質(zhì)含量差異顯著，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生了影響。

2.3.1 酯類(lèi)香氣物質(zhì)

酯類(lèi)是影響葡萄酒香氣的重要揮發(fā)性化合物，由脂肪酸和醇在酯酶催化作用下可形成酯，它們能賦予葡萄酒果香和花香[16-17]。從圖2和表2可以看出，山葡萄汁、對(duì)照與酶處理組的酯類(lèi)總量之間差異顯著，分別為55.35、66.62和89.34 mg/L；山葡萄汁中己酸乙酯(香蕉、青蘋(píng)果)、乙酸己酯(水果、花香)、辛酸乙酯(花香、香蕉、梨)、癸酸乙酯(花香、肥皂味)含量顯著高于山葡萄酒(p<0.05)，其他檢測(cè)到的酯類(lèi)含量均低于山葡萄酒，山葡萄汁檢測(cè)到酯類(lèi)種類(lèi)數(shù)量為13種遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于山葡萄酒的28種，說(shuō)明山葡萄汁以果香和花香等品種的酯香為主，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后山葡萄酒產(chǎn)生了大量發(fā)酵酯香，豐富‘雙優(yōu)’山葡萄酒的香氣風(fēng)味。比較對(duì)照和酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒酯類(lèi)成分可知，己酸甲酯只在酶處理組檢測(cè)到。酯類(lèi)含量較高的前4種依次為乙酸乙酯>己酸乙酯>辛酸乙酯>乙酸異戊酯，它們經(jīng)酶處理后含量分別較對(duì)照提高了11.76%、37.25%、101.81%、51.35%。在酯類(lèi)物質(zhì)中有20種酯類(lèi)物質(zhì)酶含量處理組顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。其中，羥基酯類(lèi)檢測(cè)到2-羥基-4-甲基戊酸乙酯，它的配基與糖類(lèi)形成糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)，經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后釋放出來(lái)，其酶處理組含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，并較對(duì)照組提高了150%。說(shuō)明β-葡萄糖苷酶可以水解‘雙優(yōu)’山葡萄酒酯類(lèi)、糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)，促進(jìn)酒中的酯類(lèi)香氣物質(zhì)形成。

2.3.2 醇類(lèi)香氣物質(zhì)

醇類(lèi)物質(zhì)是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)重要揮發(fā)性化合物，主要由酵母代謝、酯類(lèi)的水解作用、糖苷酶水解糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)產(chǎn)生的[18]。由表2和圖2可知，山葡萄汁、對(duì)照與酶處理組的醇類(lèi)總量之間差異顯著(p<0.05)，分別為16.81、42.94和68.53 mg/L；山葡萄汁中醇類(lèi)種類(lèi)(4種)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于山葡萄酒(8種)，說(shuō)明醇類(lèi)香氣成分主要是山葡萄酒經(jīng)酵母菌發(fā)酵所產(chǎn)生的。比較對(duì)照和酶處理組‘雙優(yōu)’山葡萄酒醇類(lèi)香氣物質(zhì)可知，酶處理組均顯著高于對(duì)照(p<0.05)；醇類(lèi)含量較高的前2種依次為異戊醇(醇香、澀味)>正己醇(草本植物、青草)，它們經(jīng)酶處理后含量分別較對(duì)照提高了41.77%和419.54%。其中，正己醇是C6化合物糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)，它的配基與糖類(lèi)形成糖苷，經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后釋放出來(lái)，所以酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒的正己醇含量顯著增加，促進(jìn)酒中的C6化合物類(lèi)糖苷香氣物質(zhì)的形成。

醇類(lèi)物質(zhì)根據(jù)C的數(shù)量可以分為低級(jí)醇(≤C6)和高級(jí)醇(>C6)。低級(jí)醇具有刺激、辛辣和澀味，是葡萄酒中醇香的來(lái)源。高級(jí)醇又被稱(chēng)為雜醇，其含量低于300 mg/L時(shí)會(huì)提高葡萄酒復(fù)雜性，而含量高于400 mg/L則會(huì)給葡萄酒帶來(lái)負(fù)面影響[19-20]。從表2可知，在‘雙優(yōu)’山葡萄酒檢測(cè)2種低級(jí)醇分別是異戊醇(C5H12O)和正己醇(C6H14O)，它們含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他醇類(lèi)物質(zhì)，并且酶處理組含量顯著高于對(duì)照組；而檢測(cè)到的高級(jí)醇種類(lèi)有6種，含量均低于300 mg/L，酶處理組含量高于對(duì)照組。

說(shuō)明β-葡萄糖苷酶促進(jìn)葡萄酒中產(chǎn)生醇類(lèi)物質(zhì)，增加葡萄酒的醇香、草香和花香，使葡萄酒產(chǎn)生令人愉悅的復(fù)雜、濃郁的香氣。

表2 香氣成分分析結(jié)果 單位：mg/L

續(xù)表2

注：同一行不同字母表示顯著性差異(p<0.05，n=3);“NA”表示未檢測(cè)出成分;“—”表示未查到相關(guān)資料或計(jì)算出OAVs。

2.3.3 酸類(lèi)香氣物質(zhì)

葡萄酒中酸類(lèi)揮發(fā)性化合物主要來(lái)源于乳酸菌等細(xì)菌代謝，具有油脂、酸腐以及奶酪的氣味[21]。從表2和圖2可知，酶處理與山葡萄汁和對(duì)照組的酸類(lèi)總量之間差異顯著(p<0.05)，其總量分別為3.59、1.87和1.00 mg/L；山葡萄汁酸類(lèi)種類(lèi)(2種)小于山葡萄酒(4種)。比較對(duì)照和酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒處理組酸類(lèi)香氣物質(zhì)可知，在檢測(cè)出4種酸類(lèi)物質(zhì)中，2-甲基-2-己醇醋酸只在酶處理組檢測(cè)到。而含量較高的前2種依次為辛酸(奶油、杏仁)>正癸酸(腐臭、脂肪)，酶處理組顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，它們經(jīng)酶處理后含量分別較對(duì)照提高了306.94%和117.65%。研究認(rèn)為辛酸在低濃度時(shí)會(huì)有奶酪和奶油的香味，而當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)則會(huì)出現(xiàn)腐敗和刺激味等異味[22]，而正癸酸也呈現(xiàn)腐臭味道。因此考慮β-葡萄糖苷酶處理使葡萄酒產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

2.3.4 酮、醛和揮發(fā)性酚類(lèi)香氣物質(zhì)

醛和酮主要是由酸的脫羧和醇的氧化形成[23]。從表2和圖2可知，酮、醛和酚類(lèi)3大類(lèi)香氣物質(zhì)中，山葡萄汁只檢測(cè)到癸醛(橘子)和苯乙醛(花香、蜂蜜)2種醛類(lèi)成分。在檢測(cè)出的3種酮類(lèi)物質(zhì)中，甲壬酮只在酶處理組檢測(cè)到，酶處理組與對(duì)照組酮類(lèi)總量差異顯著(p<0.05)，分別為9.63和5.77 mg/L。在醛類(lèi)物質(zhì)中，山葡萄汁、對(duì)照與酶處理組的醛類(lèi)總量之間差異顯著(p<0.05)，分別為0.06、0.61和1.09 mg/L。揮發(fā)酚類(lèi)物質(zhì)中只檢測(cè)到2,4-二叔丁基苯酚1種，酶處理與對(duì)照組揮發(fā)性酚類(lèi)差異顯著(p<0.05)，分別為0.60和0.09 mg/L。在酮、醛和揮發(fā)性酚類(lèi)香氣物質(zhì)中，含量較高前3種依次為二異丁基酮>2,4-二叔丁基苯酚>安息香醛，它們經(jīng)酶處理后含量分別較對(duì)照提高了62.32%、566.66%、86.96%。

2.3.5 糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)

香氣糖苷除去酯類(lèi)中羥基酯類(lèi)物質(zhì)和醇類(lèi)中C6化合物類(lèi)，含量最豐富糖苷類(lèi)物質(zhì)為萜烯類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)和苯衍生物類(lèi)。它們的配基與糖類(lèi)物質(zhì)通過(guò)糖苷鍵結(jié)合形成香氣的前體物質(zhì)，在酸或酶的水解作用下，其配基可以釋放出來(lái)形成游離香氣物質(zhì)[24-25]。從表2和圖2可知，檢測(cè)到單萜烯類(lèi)有2種、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)1種和苯衍生物類(lèi)2種，山葡萄汁、對(duì)照與酶處理組的糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)總量之間差異顯著(p<0.05)，其含量分別為2.09、7.28和12.23 mg/L。在5種糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)中，香葉基丙酮只在酶處理組中檢測(cè)到。苯衍生物類(lèi)糖苷總含量最高，其次是C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)，單萜烯類(lèi)總含量最少。比較對(duì)照和酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)可知，經(jīng)酶處理組后其總含量較對(duì)照組提高了11.23%，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶可以水解‘雙優(yōu)’山葡萄酒糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)，促進(jìn)酒中的香氣物質(zhì)形成。

圖2 不同種類(lèi)香氣物質(zhì)總含量Fig.2 Total content of different classes of aroma compounds

2.4 山葡萄酒OAVs分析

OAVs是用于評(píng)價(jià)各風(fēng)味化合物對(duì)酒香氣貢獻(xiàn)的指標(biāo)。OAVs>1的成分為樣品的主體呈香物質(zhì)，OAVs越大，對(duì)香氣的貢獻(xiàn)也越大[32-33]。對(duì)‘雙優(yōu)’山葡萄酒檢測(cè)和鑒定的揮發(fā)性化合物進(jìn)行OAVs的計(jì)算，將OAVs>1的物質(zhì)進(jìn)行了歸納和總結(jié)，如表3所示。從表3可知，OAVs>1的香氣成分共19種，根據(jù)香氣感官特征和風(fēng)味輪盤(pán)劃分[22-33]，‘雙優(yōu)’山葡萄酒的香氣成分分為9個(gè)系列，包括化學(xué)味、脂肪味、刺鼻味、土壤味、堅(jiān)果味、焦糖味、花香味、植物味、果香味，計(jì)算各系列對(duì)照與酶處理組葡萄酒香氣強(qiáng)度對(duì)比如圖3所示。從圖3可知，各系列香氣對(duì)葡萄酒貢獻(xiàn)程度依次為果香>花香>焦糖味>植物味>脂肪味>土壤味>堅(jiān)果味>刺鼻味>化學(xué)味，酶處理組對(duì)葡萄酒貢獻(xiàn)程度高于對(duì)照。山葡萄汁果香與山葡萄酒無(wú)明顯差異，其他香氣遠(yuǎn)低于酶處理山葡萄酒。其中，山葡萄汁中己酸乙酯(香蕉、青蘋(píng)果)、辛酸乙酯(花香、香蕉、梨)、癸酸乙酯(花香、肥皂味)對(duì)葡萄酒貢獻(xiàn)程度高于山葡萄酒。

比較對(duì)照和酶處理‘雙優(yōu)’山葡萄酒OAVs可知，‘雙優(yōu)’山葡萄酒中酯類(lèi)成分對(duì)葡萄酒香氣貢獻(xiàn)程度最大，主要呈果香和花香。醇類(lèi)貢獻(xiàn)次之，主要呈植物香和土壤味。果香成分中己酸乙酯(香蕉，青蘋(píng)果)、乙酸異戊酯(香蕉)、丁酸乙酯(草莓)的OAVs均大于30，酶處理OAVs較對(duì)照組分別提高了37.17%、51.42%、46.18%，在酯類(lèi)成分中貢獻(xiàn)較大。花香成分中辛酸乙酯(甜味、花香、香蕉、梨)和癸酸乙酯(花香、肥皂味)的OAVs均小于16，酶處理組OAVs較對(duì)照組分別提高了101.7%和72.4%。植物香成分中正己醇(草本植物、青草味)和蘑菇醇(蘑菇味)OAVs均小于10，在醇類(lèi)成分中貢獻(xiàn)較大，酶處理組OAVs分別較對(duì)照組提高了420.25%和95.70%。脂肪香成分主要來(lái)自天竺葵醛(脂肪、柑橘、植物)、天竺葵醇(脂肪、花香)和辛酸(奶油、杏仁)，酶處理OAVs分別較對(duì)照提高了66.58%、283.66%、307.64%，其中天竺葵醛的OAVs值高于其他2種脂肪香成分。焦糖味源自苯乙醛(花香、蜂蜜)，其酶處理OAVs值高達(dá)71.72，較對(duì)照提高了53.82%。

表3 香氣成分OAVs結(jié)果Table 3 The OAVs results of aroma compounds OAVs

注：1-化學(xué)味；2-土壤味；3-堅(jiān)果味；4-花香味；5-果香味；6-焦糖味；7-植物味；8-脂肪味；9-刺鼻味

圖3 對(duì)照與酶處理葡萄酒各系列香氣強(qiáng)度對(duì)比Fig.3 Comparison of wine aroma intensity in control and enzyme treatment

3 結(jié)論

本文以‘雙優(yōu)’山葡萄為原料發(fā)酵葡萄酒，研究β-葡萄糖苷酶在酒發(fā)酵過(guò)程中活力變化以及對(duì)酒品質(zhì)和香氣的影響。研究表明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，β-葡萄糖苷酶活力先增加后減小，對(duì)照組和酶處理組活力最大值分別為12.46和72.42 U/L，說(shuō)明‘雙優(yōu)’山葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)生少量β-葡萄糖苷酶，而添加β-葡萄糖苷酶在‘雙優(yōu)’山葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中活力受到抑制。比較對(duì)照和酶處理組‘雙優(yōu)’山葡萄酒理化特性可知，對(duì)照組總糖含量和酒精度低于酶處理組，對(duì)照組總花色苷含量高于酶處理組。酶處理組香氣成分含量顯著高于山葡萄汁和對(duì)照山葡萄酒處理組，山葡萄汁、對(duì)照和酶處理組香氣物質(zhì)總量分別為76.18、124.28和184.99 mg/L，種類(lèi)分別為24、50和54種；檢測(cè)出香氣成分共分為9大類(lèi)，其含量大小依次為酯類(lèi)、醇類(lèi)、苯衍生物類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)、揮發(fā)性酚類(lèi)和單萜烯類(lèi)；其中，檢測(cè)出2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、正己醇、里哪醇氧化物、香葉基丙酮、大馬士酮、芐醇、苯乙醇7種糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)，經(jīng)酶處理山葡萄酒中7種糖苷類(lèi)香氣物質(zhì)含量分別顯著高于對(duì)照組。檢測(cè)出19種OAVs大于1的香氣成分分為化學(xué)味、花香味和果香味等9個(gè)系列，其中果香味對(duì)山葡萄酒風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，并且酶處理對(duì)葡萄酒貢獻(xiàn)程度高于對(duì)照組。因此，β-葡萄糖苷酶對(duì)‘雙優(yōu)’山葡萄酒香氣成分具有顯著的影響。