超聲處理對腎豆蛋白乳化活性和結構的影響

楊柳，覃小麗，李依燦，鐘金鋒，曾凡坤

(西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶,400715)

腎豆(又稱花豆、虎豆等)是一種營養豐富且廉價的豆科植物。腎豆營養價值高，是一種高蛋白、高碳水化合物、低脂的優質食物資源。腎豆中含有20%～30%的蛋白質，具有良好的氨基酸組成[1-2]，因此腎豆蛋白是優質的植物蛋白質。腎豆蛋白除了為人類提供基本的營養之外，還有一些有益的生物學活性，例如抗組胺、抗腫瘤、抗真菌、抗昆蟲活性、免疫調節和抗人類免疫缺陷病毒等[3]，有著良好的開發前景。

國內外目前關于腎豆蛋白的研究有腎豆蛋白的提取工藝[4-5]、腎豆蛋白的功能性質[4,6]、腎豆蛋白水解物的性質[7-9]等。乳化性是蛋白質功能特性中的一項重要性質，然而與酪蛋白和白蛋白等具有優良乳化性的蛋白質相比，腎豆蛋白的乳化性較差[6]。改善腎豆蛋白的乳化性質對提高腎豆蛋白相關乳化食品的乳化性質等方面具有重要意義，進一步滿足現代食品加工的需求。YIN等[10]研究發現高壓處理能顯著提高腎豆蛋白質分離物的乳化活性指數(emulsifying activity index，EAI)。然而，尚未有利用超聲處理手段研究腎豆蛋白乳化性質的報道；超聲處理后腎豆蛋白的乳化性質受環境因素的影響規律也尚未清楚；超聲處理后腎豆蛋白的微觀表面形貌和結構的變化也有待研究。因此，本文旨在通過超聲處理改善腎豆蛋白的乳化性質，考察超聲處理條件(超聲功率、超聲時間)以及環境因素(pH、溫度)對腎豆蛋白EAI的影響，并進一步借助掃描電鏡、紅外光譜和拉曼光譜分析腎豆蛋白在超聲處理前后的微觀表面形貌及結構變化，以期擴大腎豆蛋白在食品工業的應用范圍并為腎豆的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎豆(蛋白質含量約23%[11])，產于重慶黔江；超純水，Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)制備；大豆油，中糧福臨門食品營銷有限公司；KBr，光譜純，天津市光復精細化工研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機(探頭直徑20 mm)，寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JSM-6510LV10800鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司；Spectrum 100紅外光譜，美國Perkin-Elmer公司；DXR2拉曼光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腎豆蛋白的提取

將去皮腎豆置于50 ℃烘箱中干燥48 h，再將其用粉碎機粉碎成腎豆粉。采用堿溶酸沉法提取腎豆蛋白[12]，并稍作改進。將腎豆粉與水按1∶10(g∶mL)的比例混合，用2 mol/L NaOH溶液調節pH至9.0。將混合液置于30 ℃的水浴鍋內以500 r/min的轉速攪拌3 h，得到堿提取液。在5 000 r/min的轉速下將堿提取液離心7 min，分離得到含蛋白質的上清液和沉淀。沉淀與水按1∶5(g∶mL)的比例混合，重復上述過程2次。用0.1 mol/L HCl溶液將含蛋白質的上清液pH調至4.5，然后在8 000 r/min的轉速下離心20 min，分離出沉淀并冷凍干燥，即得到腎豆蛋白(提取率15%～20%)。將腎豆蛋白置于干燥器中密封保存，用于后續實驗。腎豆脂肪含量低[4]，并且脫脂處理可能對蛋白質造成不利影響，故本實驗不對腎豆蛋白進行脫脂處理。

1.3.2 超聲波處理

將腎豆蛋白配成100 mL 60 g/L的溶液，在不同的超聲功率(240、360和600 W)和超聲時間(10、20和30 min)下處理，超聲過程中通過冰水浴控制蛋白溶液溫度在49 ℃以下，然后將超聲處理后的蛋白溶液進行冷凍干燥。

1.3.3 環境因素對腎豆蛋白乳化活性的影響

影響蛋白質乳化性的因素很多，本環節選擇pH和溫度這2個較為重要的環境因素研究其對腎豆蛋白乳化活性的影響。分別將不同超聲條件處理后的腎豆蛋白溶于10 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，配成30 mL的2 g/L樣品溶液。室溫下將腎豆蛋白樣品溶液調節至不同pH(3、4、5、7和8)然后水浴攪拌3 h；或者將腎豆蛋白樣品溶液在不同的溫度(20、30、40、60和70 ℃)下水浴攪拌3 h。然后，采用比濁法測定EAI以評價pH及溫度處理對腎豆蛋白的乳化活性的影響。

EAI的測定參照PEARCE等[13]方法進行，并稍作改進。向腎豆蛋白樣品溶液中加入10 mL大豆油，10 000 r/min的轉速下均質1 min。用1 g/L SDS溶液將50 μL均質后的樣液稀釋100倍，測定稀釋液在500 nm處的吸光度，SDS溶液作為空白。按照公式(1)計算腎豆蛋白的EAI(m2/g)。

(1)

式中：A，500 nm處的吸光度；N，稀釋倍數(此處為100)；c，腎豆蛋白溶液的質量濃度，g/mL；φ，油相體積分數。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

采用JEOL掃描電鏡系統檢測腎豆蛋白在超聲處理前后的微觀表面形貌變化。將腎豆蛋白樣品固定在樣品架上并噴射一層薄金，高真空條件下，在15 kV的加速電壓下進行SEM檢測并選取具有代表性的區域拍攝。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法進行紅外光譜分析。將KBr置于120 ℃的烘箱中干燥2 h后研磨，取5.00 mg腎豆蛋白均勻分散在100 mg研磨過的KBr中，再快速研磨混合均勻。取適量混合粉末壓片，使用Spectrum 100紅外光譜儀進行掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描次數32次，采用紅外光譜儀自帶操作軟件采集及處理紅外圖譜。

1.3.6 拉曼光譜分析

將腎豆蛋白均勻地鋪在單凹載玻片的凹部，用MPlan 20×/0.40物鏡觀察，選取清晰典型區域進行拉曼激光散射。光闌選用50 μm狹縫，激光波長785 nm，激光能量30.0 mW，測量拉曼譜范圍為3 378～50 cm-1，曝光時間10 s，曝光次數為30。

圖譜處理：拉曼圖譜基線校正、歸屬采用OMNIC 8.0軟件，歸一化處理以苯丙氨酸的(1 003±1)cm-1作為歸一化因子[14]。然后使用PeakFit 4.12軟件進行曲線擬合，計算各結構的百分含量。

1.4 數據處理

各實驗重復2次，各樣品的指標進行3次平行測定，以平均值±標準偏差表示結果。使用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析(p<0.05時判斷組間存在顯著差異)，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 pH對超聲處理的腎豆蛋白EAI的影響

大多數食品體系呈中性偏酸性或者弱堿性。因此，本環節考察的pH為3～8，以研究不同超聲功率處理后的腎豆蛋白在此pH范圍內的EAI變化規律。由圖1可知，不同超聲功率處理的腎豆蛋白EAI受pH的影響規律是一致的，并且與未超聲處理的腎豆蛋白EAI隨pH的變化趨勢一致，說明超聲處理不改變pH對腎豆蛋白EAI的影響機制。腎豆蛋白EAI均隨pH的增大呈現先減小后增大的趨勢，這與NNADOZIE等[15]的研究結果一致。腎豆蛋白在pH 5時EAI最小，這是由于在腎豆蛋白的等電點(pI 4.5)附近，因為缺乏靜電斥力，蛋白質間的疏水相互作用導致蛋白質聚集甚至沉淀，溶解度顯著降低，參與乳化的蛋白質少，故EAI較小。反之，當pH遠離腎豆蛋白的等電點時，蛋白質帶有電荷而存在一定的靜電斥力，腎豆蛋白的溶解度增大，故EAI增大。超聲功率幾乎不改變腎豆蛋白在等電點附近(pH 4～5)的EAI，但在遠離等電點的環境下對腎豆蛋白EAI有較為明顯的影響。240 W超聲處理在遠離等電點的pH下可提高腎豆蛋白的EAI。在pH 5～8時，經較大超聲功率(≥360 W)處理后的腎豆蛋白EAI明顯小于未超聲的腎豆蛋白EAI。這說明適當強度的超聲功率可提高腎豆蛋白EAI，而過高的超聲功率反而會使EAI減小。這可能由于適當超聲功率(240 W)使蛋白質空間結構適當分散，蛋白質變性程度小，疏水基團暴露，進而增強蛋白質的表面疏水性，從而使EAI提高[16]。而過高的超聲功率會使原來分散的蛋白質空間結構發生改變，蛋白質變性程度增大，故EAI減小[17]。經過240 W的超聲功率處理，腎豆蛋白的乳化性質較好，因此選擇240 W的超聲功率處理腎豆蛋白，考察pH對不同超聲時間處理的腎豆蛋白EAI的影響。

圖1 pH對不同超聲功率處理的腎豆蛋白EAI的影響Fig.1 Effect of pH on the EAI of kidney bean protein treated with different ultrasonic power

在240 W的功率下，不同超聲時間處理后的腎豆蛋白在不同pH下的EAI的變化規律如圖2所示。由圖2可知，不同超聲時間處理的腎豆蛋白EAI均隨pH的增大呈現先減小后增大的趨勢，與圖1呈現的規律一致。在遠離等電點附近(pH 4～5)的pH下，超聲處理10 min使腎豆蛋白EAI增大。與未超聲處理的腎豆蛋白EAI相比，超聲處理時間過長(20和30 min)的腎豆蛋白EAI在一定程度上減小。這可能是因為長時間持續超聲處理使蛋白質變性嚴重，不溶性蛋白質增多，EAI隨之減小[18]。因此，在240 W的功率下超聲處理10 min可在一定程度上改善腎豆蛋白在遠離等電點的pH下的EAI。

圖2 pH對不同超聲時間處理的腎豆蛋白EAI的影響Fig.2 Effect of pH on the EAI of kidney bean protein treated with different ultrasonic time

2.2 溫度對超聲處理的腎豆蛋白EAI的影響

熱處理作為食品工業中重要的改善食品品質、延長食品貯藏期的方式，對食品體系的性質有重要影響。因此，本環節研究不同超聲功率處理后的腎豆蛋白在不同溫度(20～70 ℃)下的EAI變化規律。由圖3可知，超聲處理后的腎豆蛋白在不同溫度下的EAI變化趨勢與未超聲的相似。不同超聲功率處理及未超聲處理的腎豆蛋白EAI在20～60 ℃內隨溫度升高而增大，可能是由于適當提高溫度使蛋白質結構迅速展開，使其疏水基團暴露，從而提高乳化性能[19]。與未超聲處理的腎豆蛋白EAI比較，240 W的超聲處理顯著提高腎豆蛋白EAI，40 ℃時可提高37.12%；而經360 W和600 W的超聲處理后的腎豆蛋白EAI卻顯著降低，70 ℃時經360 W超聲處理10 min甚至降低50.36%。當溫度從60 ℃升高到70 ℃，低功率(240 W)超聲處理和未超聲處理的腎豆蛋白EAI有繼續提高的趨勢，而較高超聲功率(≥360 W)處理的腎豆蛋白EAI有下降的趨勢，說明高溫對高功率處理的腎豆蛋白EAI影響更大。由圖3可知，240 W的超聲處理在所考察的溫度范圍內可增大腎豆蛋白EAI。因此，選擇在240 W的超聲功率下用不同時間處理腎豆蛋白，研究溫度對所得蛋白的EAI的影響。

圖3 溫度對不同超聲功率處理的腎豆蛋白EAI的影響Fig.3 Effect of temperature on the EAI of kidney bean protein treated with different ultrasonic power

不同超聲時間處理后的腎豆蛋白EAI隨溫度的變化趨勢如圖4所示。由圖4可知，在所考察的溫度范圍內，超聲10 min的腎豆蛋白EAI顯著高于未經超聲處理的腎豆蛋白EAI；超聲處理20和30 min的腎豆蛋白EAI與未經超聲處理的腎豆蛋白EAI無顯著差異。可見，在240 W的功率下超聲處理10 min有利于改善腎豆蛋白在不同溫度(20～70 ℃)下的EAI。

圖4 溫度對不同超聲時間處理的腎豆蛋白EAI的影響Fig.4 Effect of temperature on the EAI of kidney bean protein treated with different ultrasonic time

2.3 掃描電鏡觀察

通過掃描電鏡對腎豆蛋白的微觀表面形貌進行觀察，結果如圖5所示。未經超聲處理的腎豆蛋白呈連續片狀，表面較為粗糙，有較淺的褶皺(圖5-A/a)。與未經超聲處理的腎豆蛋白比較，經過超聲處理的蛋白質表面形貌均有顯著的變化，整體呈塊狀堆積形態(圖5-B、C、D和E)。這些微觀形貌的變化可能是由于超聲過程中空化泡崩潰時的沖擊波、剪切力致使蛋白質分子間的氫鍵和范德華力發生斷裂[20]，破壞蛋白質分子之間的交聯[21]。超聲功率240 W下處理10 min的腎豆蛋白(圖5-B/b)表面褶皺減弱，更加光滑，而將超聲功率提高到360 W(圖5-C/c)后，腎豆蛋白的表面增加了許多小突起且出現了少許微小孔隙。在360 W的超聲功率下處理20 min(圖5-D/d)和在600 W的超聲功率下處理20 min(圖5-E/e)的腎豆蛋白微觀形貌無明顯差別，且與在360 W的超聲功率下處理10 min(圖5-C/c)的腎豆蛋白的微觀形貌差別不大。這說明超聲功率或超聲時間達到一定大小后再繼續增大對腎豆蛋白的微觀表面形貌無顯著影響。

A/a-未超聲;B/b-240 W 10 min;C/c-360 W 10 min;D/d-360 W 20 min;E/e-600 W 20 min圖5 腎豆蛋白的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of kidney bean protein

2.4 超聲處理前后腎豆蛋白的傅里葉紅外光譜

圖6 腎豆蛋白的紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of kidney bean protein

圖7 腎豆蛋白在酰胺I帶的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of kidney protein in Amide I band

2.5 超聲處理前后腎豆蛋白的拉曼光譜

圖8 腎豆蛋白的拉曼光譜Fig.8 Raman spectra of kidney bean protein

圖9 腎豆蛋白在酰胺I帶的拉曼光譜Fig.9 Raman spectra of kidney protein in Amide I band

蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲。α-螺旋結構表征蛋白質分子的規整性，β-折疊和轉角結構反映蛋白質分子的松散性[24]。分析拉曼圖譜并計算出腎豆蛋白的二級結構百分含量，如圖10所示。由圖10可知，超聲處理對無規卷曲結構的含量無明顯影響。在240 W的超聲功率下處理10 min，腎豆蛋白的α-螺旋結構含量減少，而β-折疊和β-轉角結構的總含量增多，這表明腎豆蛋白結構由規整向松散轉化。然而，高強度超聲功率(≥360 W)和長時間(≥20 min)超聲處理都使腎豆蛋白的α-螺旋結構含量增多，β-折疊和β-轉角結構的總含量減少，這說明高強度超聲功率或長時間超聲處理都使腎豆蛋白的松散性更弱。松散的蛋白質結構更加利于其乳化性質的發揮。因此，腎豆蛋白的二級結構含量驗證了超聲處理對腎豆蛋白乳化活性的影響結果。

圖10 不同處理條件下腎豆蛋白的二級結構百分含量Fig.10 The composition of secondary structure of kidney bean protein

3 結論

本文采用超聲處理手段研究腎豆蛋白的乳化活性、微觀形貌和結構。一定的超聲處理(超聲功率240 W，超聲時間10 min)在遠離等電點時可增大腎豆蛋白EAI，在所考察溫度范圍(20～70 ℃)顯著增大腎豆蛋白EAI；而過高功率(≥360 W)或長時間(≥20 min)的超聲處理使腎豆蛋白EAI在不同pH下有不同程度的減小，在所考察溫度范圍顯著降低。超聲處理使腎豆蛋白由連續片狀變為塊狀堆積形態，并改變了腎豆蛋白的二級結構。超聲處理作為一種改變腎豆蛋白結構和乳化性質的手段，對腎豆蛋白的進一步研究提供理論依據，并為超聲處理在乳化體系中對蛋白質的改性機理提供理論參考。