Box-Behnken響應面法優化辣木葉蛋白超聲提取工藝研究

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(1. 齊齊哈爾大學，齊齊哈爾 161006；2. 中國標準化研究院，北京 100191；3. 北京市理化分析測試中心，北京 100089)

1 引言

辣木(MoringaoleiferaLam)是一種具有較高經濟價值的熱帶植物[1]，其葉片營養豐富，富含維生素、葉酸、泛酸、鈣、鐵、硒等營養物質[2]，尤其是其中的植物蛋白含量通常可達15%，是酸奶的2倍[3,4]；且其蛋白質中所含的必需氨基酸高于FAO/WHO/UNO對2～5歲兒童推薦的最適氨基酸攝取量[5]。因此，辣木葉是目前已知的最好的植物蛋白來源之一。辣木葉中蛋白質常用的提取方法主要有超聲提取法[6-8]、堿提取法[9]、酶提取[10,11]、膜過濾法[12]，其中超聲提取法憑借操作簡單、省時省力、綠色環保的優勢被廣泛使用。

響應曲面設計方法(Response Surface Methodology，RSM)由George E. P. B.和Wilson K. B.于1951年提出[13]。它的核心是利用合理的試驗設計方法設計一系列實驗，得到一定量的數據，通過多元二次回歸方程探討擬合因素和響應變量之間的關系，獲得各因素的最優參數，解決多變量問題[14]。響應面法具有試驗設計合理、精密度高、預測性能好，能研究幾種因素間交互作用等優點[15]，得到了許多研究人員的關注和應用，近年來已被廣泛應用于精細化工[16,17]、機械加工[18]、農業[19]等領域。

本實驗重點研究了干燥辣木葉中蛋白質的超聲提取工藝，通過單因素試驗的方法考察了pH值、料液比、超聲功率、提取溫度和提取時間5個因素對辣木葉中蛋白質的提取效率的影響；然后利用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型對辣木葉中蛋白質的提取條件進行優化，通過分析總結確定了辣木葉中蛋白質的最佳提取工藝，該方法得率較高，具有較好的應用前景。以此工藝條件對市售的76種辣木葉制品中的蛋白質進行提取和分析。該方法為辣木葉在保健食品領域的應用提供技術支持。

2 材料與方法

2.1 材料和試劑

云南、廣東、廣西、福建、四川等不同產區隨機抽樣26個辣木葉樣品，19個辣木葉干粉樣品，31個辣木茶樣品，各取500 g至于50 ℃烘箱中，烘干后取出粉碎，過80目篩，制成辣木葉粉備用。

牛血清白蛋白(生化純)，濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、考馬斯亮藍G250，均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；超純水為實驗室純水機自制。

2.2 儀器設備

QFN-5200DTS超聲清洗器(上海觀謀事業有限公司)；Eppendorf Research移液器(量程20～200 μL，艾本德中國有限公司)；SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；YP3002電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；PHS-3D型實驗室pH計(上海三信儀表廠)。

2.3 試驗方法

2.3.1 辣木葉中蛋白質超聲提取工藝流程

準確稱取上述任意辣木葉粉樣品1.00 g放入250 mL燒杯中，加入特定pH特定量的超純水，超聲提取。將超聲處理后的固、液混合物分批次移入50 mL離心管中，5000 r/min離心10 min，合并上清液，測定上清液中蛋白質含量，于4 ℃冰箱中保存。

2.3.2 辣木葉中蛋白質含量測定

蛋白質測定方法參考考馬斯亮藍G-250法[20]。以牛血清蛋白繪制蛋白質測定標準曲線，根據光度和標準曲線計算辣木樣品中蛋白質含量，根據下述公式計算蛋白質提取率，計算公式為：

蛋白質提取率%=

2.3.3單因素試驗對辣木葉中蛋白質提取率的影響

固定溶劑pH值、料液比、提取溫度、超聲功率和提取時間5種因素中的4種，在合理范圍內考察單因素對辣木葉中蛋白質提取率的影響。其中pH值的考察范圍為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0；料液比的考察范圍為1∶40(g/mL)、1∶60(g/mL)、1∶80(g/mL)、1∶100(g/mL)、1∶120(g/mL)、1∶140(g/mL)、1∶160(g/mL)；超聲功率的考察范圍為40 W、45 W、50 W、55 W、60 W、65 W、70 W，提取溫度的考察范圍為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃；超聲提取時間的考察范圍為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。

2.3.4 響應面法分析試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，運用Design Expert 8.0.6軟件，以溶劑pH、料液比、超聲功率、提取溫度、超聲時間5個因素為自變量，3個水平的方式進行正交試驗，以辣木葉中蛋白質的提取率為指標，考察各因素的影響水平，對其提取工藝進行優化。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗對辣木葉中蛋白質提取率的影響

3.1.1 溶劑 pH的影響

溶劑pH值對辣木葉中蛋白質提取率的影響如圖1a所示，當溶劑pH值在8.0～10.0范圍內逐漸升高時，蛋白質的提取率不斷提高；溶劑pH為10.0時蛋白質提取率達到最大值35.7%，繼續增加溶劑pH，蛋白質提取率下降。這可能因為當pH在8.0～10.0范圍內逐漸升高時，隨著堿濃度的逐漸增大，溶液中蛋白質上較多的氨根離子呈現電離狀態，得到的游離蛋白質逐漸增多，提取率提高；當pH大于10.0的時候蛋白質發生變性，導致蛋白出現脫氨、脫羧反應，產生蛋白沉淀，從而降低了蛋白質的提取率。實驗溶劑pH選用10.0。

料液比對辣木葉中蛋白質提取率的影響如圖1b所示。當料液比從1∶40 (g/mL)增加至1∶120 (g/mL)時，隨著溶劑量的逐漸增加，蛋白質提取率逐漸上升；當料液比等于1∶120 (g/mL)時蛋白質提取率達到最大值38.3%；繼續增加溶劑的量，蛋白質提取率并未出現太大變化。這可能是因為當液料比為1∶120 (g/mL)時植物細胞中蛋白質已經全部溶出，繼續提升溶劑的量對于蛋白質的提取率并無影響。后續實驗選用1∶120 (g/mL)的料液比。

超聲功率對辣木葉中蛋白質提取率的影響如圖1c所示。當超聲功率在40 W～50 W之間逐漸升高時，蛋白質提取率急劇升高；當超聲功率等于60 W時蛋白質提取率達到最大值38.3%；當超聲功率大于60 W時，蛋白質提取率降低。這可能因為當功率在40 W～50 W之間逐漸升高時，植物細胞壁被破壞，蛋白質容易從細胞內部溶出，但當超聲功率較大時，空化氣泡沒有足夠的時間破裂，空化效率降低，提取率下降[21]，從而降低蛋白質回收率。后續實驗選用超聲功率50 W。

超聲提取溫度對辣木葉中蛋白質提取率的影響如圖1d所示。當溫度從25℃升至50℃時，蛋白質提取率不斷上升；提取溫度為50℃時蛋白質的提取率達到最大值40.3%；繼續提高溫度，蛋白質提取率下降。這可能因為當溫度從25℃升至50℃時，蛋白質在水中的溶解度逐漸增大；當溫度繼續上升，蛋白質發生變性，形成大分子聚集體，從而降低了提取率[22]。后續實驗選用50℃。

圖1 各影響因素對辣木葉中蛋白質提取率的影響(a).pH值影響；(b).料液比影響；(c).超聲功率影響；(d).提取溫度影響；(e).提取時間影響

超聲提取時間對辣木葉中蛋白質提取率的影響如圖1e所示。當提取時間從10 min-50 min逐漸增加時，蛋白質提取率逐漸增加；50 min時蛋白質提取率最大值42.4%；當提取時間大于50 min時，提取率有小幅下降。這可能因為當提取時間在10 min-50 min之間時，隨著時間的增加蛋白質溶出量逐漸增加；當時間大于50 min，隨著提取時間的延長，細胞內的蛋白降解酶也隨之溶出，這些蛋白降解酶降解了部分溶出的蛋白[23]，降低了蛋白的提取率。后續實驗選用超聲時間50 min。

綜上所述，經單因素試驗優化后得到的最佳工藝為：溶劑pH 10.0，料液比1:120 (g/mL)，超聲功率50 W，提取溫度50 ℃，超聲時間50 min。

3.2 Box-Behnken模型對辣木中蛋白質提取率的優化

在單因素試驗與分析的基礎上，考察最優的實驗條件。以5因素3水平的方式進行正交試驗如表1所示。采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken模型對試驗進行設計，以蛋白質提取率為指標，軟件所給出的試驗方案以及測得的實驗結果如表2所示；多元回歸模型方差分析如表3所示。

表1 L46(35)試驗因素及水平

表2 Box-Behnken試驗方案及測得的試驗結果

續表2

通過Dsign Expert 8.0.6對表2中數據的擬合，得到辣木葉中蛋白質提取率Y對A、B、C、D、E的二元多次回歸方程為：

Y=42.45+0.78A+0.19B+0.32C-0.14D+0.36E-0.025AB-0.17AC+0.000AD-0.025AE+0.050BC+0.000BD+0.075BE+0.000CD+0.000CE-0.025DE-1.78A2-1.20B2-1.24C2-1.46D2-0.56E2

表3 多元回歸模型方差分析結果

注：*為P<0.01，顯著。

由表3可知，失擬項為1.47，說明該模型擬合度良好，能夠對實驗結果進行準確預測。A、B、C、D、E、AC、A2、B2、C2、D2、E2對辣木葉中蛋白質提取率影響顯著。從F值的大小可以看出，對辣木葉中蛋白提取率有影響的5個因素中，影響的大小順序為：A>E>C>B>D，即pH值>提取時間>超聲功率>料液比>提取溫度，其中pH值和提取時間兩個因素對辣木葉中蛋白提取率的影響最為顯著。

3.3 最佳提取工藝及驗證

通過Dsign Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型對實驗數據的分析，得到最佳提取條件為：pH值10.1、料液比1∶121.8 (g/mL)、提取功率50.6 W、提取溫度49.7 ℃、提取時間53.2 min，辣木葉中可溶性蛋白提取率的預測值為42.6%。實際實驗設計中，取100 g辣木葉干粉、pH值選用10.0、料液比選用1∶122 (g/mL)、超聲功率選用51 W、提取溫度選用50 ℃、提取時間選用53 min，進行放大性實驗，得到的辣木葉中蛋白的真實回收率為42.3%，與理論預測值的偏差較小，說明利用響應面分析法優化得到的辣木葉中蛋白質的提取條件可靠。

3.4 市售辣木葉中蛋白質含量比較

采用以上最佳提取工藝對從云南、廣東、廣西、福建、四川等不同產區隨機抽樣的26個辣木葉干品、19個辣木粉樣品、31個辣木茶樣品進行蛋白質提取處理，對各樣品中的蛋白質提取率進行分析，結果如表4和圖2中所示。其中辣木葉干品樣品中測得蛋白質提取率最小值為21.0%，最大值為38.1 %，平均值為27.7%；辣木粉樣品中測得蛋白質提取率最小值為19.9%，最大值為35.5%，平均值為27.0%；辣木茶樣品中測得蛋白質提取率最小值為12.9%，最大值為34.4%，平均值為28.3%。所有辣木葉產品中蛋白質含量都在10%以上，90%以上產品的蛋白質含量都在20%以上，說明辣木葉中的蛋白質非常高，可以作為植物蛋白的替代來源。

表4 辣木葉干品、辣木粉樣品、辣木茶樣品中蛋白質提取率

續表4

續表4

圖2 辣木葉產品中蛋白質提取率對比率

4 結論

結合超聲提取法和響應面法對辣木原料及其相關種產品中的蛋白質的提取條件進行了分析研究，發現pH值、提取時間、超聲功率、料液比和提取溫度等因素對蛋白質提取率的影響依次降低，其中pH值和提取時間兩個因素對辣木葉中蛋白質提取率的影響最為顯著。最佳的提取條件為pH值10.0、料液比1∶122 (g/mL)、超聲功率51 W、提取溫度50 ℃、提取時間53 min，此時得到的辣木葉中蛋白的真實回收率為42.3%，與理論預測值的偏差較小，說明利用Box-Behnken模型優化得到的辣木葉中蛋白質的提取條件可靠。本文將理論和實驗相結合，避免了重復實驗，降低了實驗工作量，提升了實驗效率。最后對辣木原料及其相關產品中得蛋白質進行了提取和測定，進一步證明了辣木葉中的蛋白質含量很高，為現有辣木相關產品的深度開發和利用提供了應用技術支持。