基于1H NMR方法的傳統發酵主食小分子代謝物組分析

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(1.北京市理化分析測試中心，北京市基因測序與功能分析工程技術研究中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100094；2.北京旗艦食品集團有限公司，北京 100194)

在我國運用傳統發酵劑(又名：老酵頭、酵子、老面、面引子)[1]發酵蒸制饅頭，具有一千多年歷史。隨著時代變遷和社會科學不斷進步，人們對蒸制饅頭的關鍵物質傳統發酵劑的關注研究從未間斷。運用傳統方法蒸制的饅頭是老祖宗留給后人的“舌尖上的美味”，是北方的傳統美食。數據顯示，每年我國40%的小麥及進口小麥用于饅頭生產[2]。商品化的饅頭因為引入自動化生產線，并且使用單一酵母發酵劑，產品質量相對穩定，生產規模較大，但風味較為單一；家庭式手工方法生產的饅頭因為使用傳統發酵劑，更多的保留了傳統特色風味，并且隨著發酵劑種類的不同風味也發生變化[3]。發酵劑中微生物菌群多樣性構成不同，發酵饅頭中產生的代謝產物也不同[4]。本實驗研究中，采用重水磷酸鹽緩沖液浸提饅頭樣品中的小分子代謝產物，并采用一維氫譜核磁共振技術方法定性及定量分析其成分構成及含量，為進一步明確傳統老酵饅頭與干酵母饅頭的異同，從而為老酵中微生物代謝組學研究提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

面粉(北京糧海食品有限公司)；傳統老酵母QJ(北京旗艦食品有限公司)；傳統老酵母ZZ(天津居民自制)；燕山牌高活性干酵母YS(河北馬利食品有限公司，批號20150704)；高活性干酵母AQ(安琪酵母(赤峰)有限公司，批號20120904)。

1.1.2 實驗儀器

CPA225D十萬分之一天平(日本賽多利斯公司)；Centrifuge 5417R高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；低溫真空冷凍儀；渦旋振蕩器(美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司)；核磁管；DRX-400型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)。

1.1.3 試劑

重水磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pD 7.0)，加入10%重水(5 mL)于50 mL 容量瓶中，加入0.5 mmol/L內標TSP(0.00431 g)，5 mmol/L 咪唑(0.017019 g)，加超純水定容至 50 mL)。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL，用水稀釋至100mL。

1.2 方法

1.2.1 饅頭樣品制作方法

老酵饅頭及酵母饅頭做法參照文獻方法。

1.2.21H NMR樣品前處理

將儲存在-20℃的饅頭樣品放置在4℃預解凍3h。將饅頭掰成小塊平放在9mm培養皿中，置于-20℃預冷凍12h，置于真空冷凍干燥儀中-45℃，0.00001 mPa(10～20 Pa)主冷凍干燥18～-24 h。

1.2.31H NMR樣品處理[5]

準確稱取100 mg樣品，粉末后置于 2.0 mL離心管中，在冰上加入 1.5 mL已冷卻的超純水，渦旋振蕩60 s之后置于冰上10 min，然后在4℃下以13000 rpm的轉速離心10 min。取1.0 mL上清液于新的離心管中，等體積加入重水磷酸鹽緩沖液，在4℃下以13000 rpm的轉速離心10 min。取1000μL上清液轉移新離心管中，-80℃保存。取500 μL上清液轉移到5 mm內徑的核磁管中進行測定。每個樣品4個平行，為了保證數據重復性，4個平行來自同一個處理。

1.2.41H NMR樣品檢測

采用 Avance III型氫質子共振頻率 600.13 MHz 核磁共振譜儀(Bruker，德國)、5 mm PATXI探頭于300 K進行檢測。一維液體1H NMR測試的參數設置如下：掃描次數為64次，脈沖序列為noesyprld，弛豫延遲為4 s，混合時間為1 s，收集時間為 2.28 s，虛擬掃描的穩態瞬變次數為4次，梯度脈沖時間為1 ms，預飽和方式壓制水峰，譜寬為7184 Hz，數據點數為32 K。

1.2.5 數據處理及統計分析[6]

1H NMR 的原始數據由儀器自帶的 XWINNMR(Version 3.5，Bruker)軟件充零，設定指數線寬因子為0.3 Hz，然后進行傅立葉轉換、相位調整、基線校正和零位移標定。利用 Chenomx NMR suite professional(version 7.0，Chenomx Inc.，Canada)軟件進行譜峰的確定及化合物定量。

2 結果與討論

2.1 4種發酵饅頭1H NMR檢測成分

采用傳統老酵頭作為發酵劑制作的2 種饅頭QJ、ZZ，與市售活性酵母發酵劑制作的2 種饅頭AQ、YS在相同的取樣條件和分析條件下進行比較，1H NMR分離鑒定各饅頭樣品中主要代謝物的種類及含量分別見表1，1H NMR圖譜見圖1。

由圖1可知，在一些區域中，四種發酵劑發酵制作的饅頭樣本中的代謝產物的種類和含量存在著一定的差異，說明4中發酵劑制作的饅頭其小分子代謝物成分各有特點。在原材料相同，發酵制作工藝類似的前提下，這種差異和特點可能是由發酵菌劑的不同導致的。

表1 4種饅頭樣品中1H NMR代謝物分析結果

續表1

續表1

圖1 4種饅頭1H NMR圖譜直觀比較

由表1得出，從QJ樣品中鑒定出29種小分子代謝物，總濃度為16.8 nmol/L，包括糖類8種(7.8 nmol/L)，酸類15種(5.7 nmol/L)，醇類4種(2.5 nmol/L)，酯類2種(0.9 nmol/L)，不含其他類；從AQ樣品中鑒定出38種小分子代謝物，總濃度為17.9 nmol/L，包括糖類10種(8.5 nmol/L)，酸類19種(3.6 nmol/L)，醇類5種(3.2 nmol/L)，酯類2種(2.0 nmol/L)，其他類2種(0.6nmol/L)；從ZZ樣品種鑒定出33種小分子代謝物，總濃度為17.7 nmol/L，包括糖類9種(8.5 nmol/L)，酸類16種(3.1 nmol/L)，醇類4種(3.1 nmol/L)，酯類2種(2.4 nmol/L)，其他類2種(0.5 nmol/L)；從YS樣品中鑒定出35種小分子代謝物，總濃度為18.9 nmol/L，包括糖類10種(9.9 nmol/L)，酸類16種(2.8 nmol/L)，醇類5種(3.3 nmol/L)，酯類2種(2.6 nmol/L)，其他類2種(0.4 nmol/L)。

2.2 4種饅頭中代謝產物的比較(圖2)

上述4種發酵劑制作饅頭樣品中小分子代謝物的比較結果顯示，主要的代謝物有糖類、酸類、醇類、酯類和其他類等。饅頭制作的主要原料面粉中的淀粉水解產生糖類化合物，淀粉或糖經發酵劑中微生物的代謝作用產生醇類化合物，高級醇氧化或氨基酸降解或醛醇縮合反應產生酯類化合物[7]。4種饅頭樣本中糖類的含量最高，這主要是因為淀粉水解直接產生或面粉中本身含有大量糖類物質，而且糖類物質多為非揮發性物質，在饅頭蒸制過程中留在饅頭中，在核磁檢測的前處理中浸提出來并被大量檢測到，含量分別占到各種樣本總含量的46.2%(QJ)、47.6%(AQ)、48.3%(ZZ)、52.1%(YS)。甘露糖是本次檢測結果中除麥芽糖、葡萄糖外含量相對較高的一種單糖，甘露糖以游離狀態存在于某些植物果皮中，如柑橘皮中，桃、蘋果等水果中有少量游離的甘露糖。其他QJ(1.9 nmol/L)含量最高，遠高于其他3種饅頭，ZZ中沒有檢出。

圖2 QJ與AQ饅頭1H NMR圖譜主成分比對分析(PC1)

醇類物質是僅次于糖類與酸類物質的代謝物。總含量超過2 nmol/L，其中阿拉伯糖醇的含量最高，分別達到1.5 nmol/L(QJ)、2.0 nmol/L (AQ)、2.2 nmol/L(ZZ)、2.0 nmol/L(YS)，自然界中存在的D-阿拉伯糖醇含量很少，生產中以活的微生物(耐滲酵母等)為細胞工廠，多種酶促反應生產D-阿拉伯糖醇，饅頭中阿拉伯糖醇高的原因可能與發酵劑中微生物(酵母)發酵有關[9]。乙醇含量較高(4種樣品中均約1 nmol/L)，雖然乙醇具有揮發性，但仍有部分留在饅頭中被檢測到。

如圖2，為區分QJ和AQ兩種饅頭貢獻較大的主要代謝化合物包括2-甲基戊二酸、丙氨酸、半胱氨酸、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、葡糖醛酸、磷酸甘油酸、延胡索酸；丙二醇、羥基丁酸、乳糖、醋酸、順烏頭酸、硫胱氨酸、葡萄糖、精氨酸、羥基丁酸和甘露糖。

3 結論

本實驗使用4種不同的發酵劑，使用同一批次面粉蒸制饅頭，利用1H NMR分析方法對4種饅頭樣品中的小分子代謝產物進行分析，并按照化合物特征分類，由此對不同發酵劑產生的代謝產物差異進行比較分析。

利用1H NMR的分析方法從饅頭樣品中一共鑒定出41種化合物，其中QJ樣品中為29種，AQ樣品中為38種，ZZ樣品中為33種，YS樣品中為35種。從代謝物種類上分析，4種發酵劑的主要產物可分為糖類、酸類、醇類、酯類、其他類，其他類在QJ樣品中未檢測到；從成分的含量上分析，4種發酵劑制作饅頭樣品呈現出各自的特色，如QJ中甘露糖(1.9 nmol/L)、乳酸鹽(1.5 nmol/L)、硫胱氨酸(0.4 nmol/L)含量較高，AQ中核糖(1.9 nmol/L)、脫氧腺苷(0.6 nmol/L)含量較高，ZZ中葡萄糖(1.6 nmol/L)、尿苷二磷酸半乳糖(0.12 nmol/L)含量較高，YS中乙醇(1.2 nmol/L)、葡糖醛酸酯(2.6 nmol/L)含量較高。結果說明發酵劑的種類不同，即發酵劑中微生物多樣性菌種的種類與組成，對饅頭中代謝產物起重要作用。

核磁共振技術在代謝組學中的應用還存在一些局限性，主要是其靈敏度較低，可能會導致一些濃度較低但發揮很大作用的化合物無法檢測或檢測不準確等問題[10]。核磁共振檢測的結果與氣質聯用技術檢測結果有著較強的互補性，后者主要側重揮發性代謝產物的分析，而前者主要針對非揮發性的小分子代謝產物進行分析，兩種檢測結果的結合可以為提供較為全面的代謝物指紋分析。