MMR與PD-L1在Ⅱ期術后結直腸癌中的差異性表達

劉巖 李慧 趙丹丹 程穎

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種發病率高的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類健康，根據中國癌癥統計數據，結直腸癌已成為我國發病率及病死率均居第5位的惡性腫瘤，其發病率呈現逐步上升趨勢［1-2］。

近年來，分子靶向治療在某些特定人群中療效顯著，基于生物標志物指導下的靶向藥物延長了患者生存并改善了生活質量，細胞程序性死亡配 體 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）和錯配修復（mismatch repair def i cient，MMR）基因已經成為免疫靶向藥物最重要的生物標志物，Pembrolizumab二線治療的推薦人群為PD-L1表達≥1%，一線治療優勢患者的PD-L1需≥50%［3-4］，同時也被獲批治療帶有MMR缺失（def i cient mismatch repair，dMMR）的實體瘤患者。

腫瘤異質性是導致腫瘤耐藥和治療療效差異的重要原因之一，腫瘤異質性包括腫瘤間異質性和腫瘤內異質性。為了探討MMR和PD-L1在同一腫瘤標本中的異質性，本研究分析結直腸癌患者腫瘤組織標本中dMMR和PD-L1的差異性和一致性，為結直腸癌未來免疫靶向治療的精準診斷提供參考。

材料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2017年10月在吉林省腫瘤醫院接受CRC根治性手術的患者50例，手術前均未接受任何治療，術后病理證實為TNMⅡ期結直腸癌。本研究得到吉林省腫瘤醫院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。入組患者基本資料：男性27例，女性23例；年齡范圍為31～65歲，中位年齡57歲；手術切除新鮮結直腸組織標本后送病理科，以10%福爾馬林固定24 h以上，制備石蠟包塊。

二、試劑

鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、Muts同 源 蛋 白 2（MutS homolog 2，MSH2）、Muts同 源 蛋 白 6（MutS homolog 6，MSH6）、減數分裂后分離蛋白2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）單克隆抗體、HRP標記兔鼠專用二抗和AEC顯色液均購自福建邁新公司，鼠抗人PD-L1單克隆抗體購自cell signaling technology公司，蘇木素購自中杉公司，PBS粉末和水性封片劑購自鼎國公司。

三、免疫組織化學

石蠟切片置于65℃干燥箱12 h，脫蠟返水后，采用枸櫞酸鹽緩沖液（PD-L1）和EDTA緩沖液（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）高壓抗原修復2 min，待溫度降至室溫后，應用3%H2O2常溫避光孵育30 min去除內源性過氧化物酶的影響，加入一抗（1:200稀釋），濕盒內4℃孵育過夜，PBS洗3遍后加入通用二抗，37℃孵育30 min，最后采用AEC顯色，蘇木素復染細胞核5 min，封片后在顯微鏡下觀察蛋白染色情況。用已知陽性切片（肺癌）做陽性對照，陰性對照切片用PBS代替一抗。

四、判定標準

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在細胞核中，當四個錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達時，即可判定為錯配修復功能完整；四種蛋白中一種以上不表達，判定為MMR表達缺失（dMMR）。判讀標準如下：在對照組織（即腫瘤周圍的正常上皮細胞、腫瘤內浸潤的淋巴細胞、間質細胞均出現細胞核著色）中強陽性表達的前提下，只要MMR蛋白在腫瘤細胞出現核著色，即判定該蛋白為陽性表達；若MMR蛋白在腫瘤細胞未出現核著色則視為MMR蛋白缺失［5-8］。

PD-L1定位于細胞膜和細胞質中，結果判斷采用陽性細胞半定量分級法［9］：先根據陽性細胞個數占整個腫瘤細胞的百分率計分，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；再根據陽性細胞染色深淺計分，不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，最后將兩者分數相乘，0分為陰性，1～4分（＋），5～8分（＋＋），9～12分（＋＋＋），以（＋）及以上表達者即統計為表達陽性。

五、統計學分析

采用SPSS17.0 統計軟件進行統計分析，定性資料采用χ2檢驗，最小頻數（T）＜5時采用Fisher精準檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MMR在Ⅱ期結直腸癌組織中的表達情況

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在細胞核中（圖1），50例CRC組織標本中每種蛋白表達缺失率分別為12%、6%、16%和24%，dMMR的總發生率為32%（16/50），其中，1種蛋白的缺失率占18.7%（3/16）；兩種以上蛋白的缺失率所占比例為68.7%（11/16）。

圖1 免疫組織化學檢測MMR蛋白在結直腸癌組織中的表達。分別于200倍和400倍鏡下拍照

二、PD-L1在Ⅱ期結直腸癌組織中的表達

PD-L1陽性可表達于結直腸癌組織的細胞膜或（和）細胞質，呈淡黃色至棕黃色細顆粒（圖2A），在50例結直腸癌組織中，PD-L1的陽性率為38%（19/50）；以肺癌組織為陽性對照（圖2C）；PD-L1陽性率隨年齡增長而增加，分別為24% vs 52%（P=0.041），但與性別、浸潤程度和分化程度等臨床病理特征均無顯著相關性（P＞0.05）（表1）。

三、PD-L1與MMR的一致性及影響因素

PD-L1在dMMR中的表達率為62.5%（10/16），明顯高于錯配修復功能完整中的表達率26.5%（9/34），差異有統計學意義（P=0.027），見表2；PD-L1在MLH1和MSH2陰性組的表達率高于陽性組，100% vs 34%，83.3% vs 31.8%，P=0.024和0.049，但與MSH6及PMS2蛋白的表達差異則無顯著統計學意義（均P＞0.05）；PD-L1與MMR的表達一致性較差（Kappa=0.343，P=0.014）。

圖2 免疫組織化學檢測PD-L1蛋白在結直腸癌組織中的表達。2A：PD-L1在結直腸癌組織中陽性表達；2B：PD-L1在結直腸癌組織中陰性表達；2C：PD-L1在肺癌組織中高表達（陽性對照）；分別于200倍和400倍鏡下拍照

表1 PD-L1表達與Ⅱ期結直腸癌患者臨床病理特征的關系

表2 PD-L1在MMR蛋白中的表達情況

討 論

免疫靶向藥物已被美國和歐盟批準用于治療多種晚期實體腫瘤，如黑色素瘤、腎癌和非小細胞肺癌等，PD-L1的表達狀況是目前較多用于臨床實踐的免疫靶向藥物療效預測標志物［4，10］。多項研究均提示非篩選的晚期結直腸癌患者對抗PD-1/PD-L1治療效果不佳［11-12］，因此，CRC目前仍需要明確指示藥物療效的生物標志物。

Le等［13］認為 KEYNOTE-028中唯一達到部分緩解的結直腸癌患者可能在基因學方面有著重要特征，并設計了一項以腫瘤基因學特征篩選患者并評估抗PD-1療效的Ⅱ期臨床試驗，研究結果提示檢測dMMR能夠預測患者抗PD-1抗體（pembrolizumab）的預后，該類型患者應用PD1抑制劑的療效更優。2017年美國FDA依照生物標志物核批的抗腫瘤療法批準pembrolizumab治療帶有dMMR的實體瘤患者。

腫瘤的瘤內異質性是導致耐藥的重要原因之一，當不同的驅動基因表達不一致時，如何優化治療方案將是未來臨床實踐的挑戰之一。本研究發現Ⅱ期術后的CRC樣本中，PD-L1的表達與MMR的一致性低，但是PD-L1與dMMR的陽性人群比例相似，約為30%左右。馮穩等［15］報道210例CRC患者（Ⅰ～Ⅳ期），其PD-L1的總陽性率為18.6%，Ⅱ期患者的陽性率為23%。本研究發現，PD-L1的表達與年齡遞增有關（P=0.041），這與Droeser等［14］研究結果一致，他們還認為PD-L1表達可能與結直腸癌淋巴結轉移有關，但與性別、分期和浸潤程度無關。Siddique等［16］分析1 000余例Ⅰ～Ⅳ期CRC后發現dMMR陽性率為15%～20%，Koopman等［17］認為dMMR的發生率隨分期逐步下降，Weiss等［18］認為右半結腸癌及近端結腸癌中dMMR陽性率高。本研究納入的患者為Ⅱ期患者，dMMR的發生率略高于Ⅰ～Ⅳ期的平均發生率，這可能與入組人群或患者的臨床分期相關。

本研究發現dMMR中PD-L1表達率高，而且與MLH1和MSH2蛋白相關。這與Kim等［19］的研究結論一致。他們檢測了203例結直腸癌患者，發現PD-L1的陽性表達與MLH1/MSH2缺失密切相關（P=0.01），該結果與本研究的結論一致。

本研究存在一定的局限性，包括缺少免疫靶向治療對于PD-L1和dMMR差異性和一致性表達患者的治療療效數據，此外，該研究方法只是定性檢測，缺少更精確的定量分析等。未來同一標本中PD-L1和dMMR的大樣本、前瞻性，多平臺（既定性又定量）的檢測分析將為揭示CRC異質性和靶向基因差異分布的個體化精準治療和預后提供更多循證醫學數據。