姜黃素干預小鼠腸道菌群并抑制結直腸癌變的實驗研究

陳文杰 蘇獻豪 王躍遷 王會鵬 葉桃 陳駿 趙加應 蔡元坤

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的腸道惡性腫瘤，目前發病率居全球第三位，據統計每年超過120萬新發病例，大約60萬患者死于結直腸癌，居癌癥相關死亡第四位［1］。結直腸癌的發生涉及到多因素、多階段、多途徑，近年來有研究發現腸道菌群失調可能在結直腸癌的發生中扮演重要角色，并且已發現多種細菌（產毒脆弱擬桿菌屬、糞腸球菌、梭桿菌屬、解沒食子酸鏈球菌等）可能是大腸致癌菌［2-5］。姜黃素是從姜黃中提取的一種天然多酚類物質，因其具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等多種藥理作用和生物學功能［6］，近年來成為研究的熱點，本實驗擬通過監測姜黃素干預小鼠成瘤過程中小鼠腸道菌群的變化，探究姜黃素的抗癌作用機制，及腸道菌群是否是其可能的作用靶點。

材料與方法

一、材料

實驗動物：C57BL/6小鼠，6周齡，25只，體重17～20 g，SPF級飼養環境，由華東師范大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（滬）2011-0031。

主要試劑：氧化偶氮甲烷、右旋葡聚糖硫酸鈉、姜黃素，均由Sigma-Aldrieh公司（美國）提供。

二、實驗方法

實驗分組及安排：25只小鼠隨機分為基礎飲食組（BD）5只、AOM/DSS造模組（MO）10只、姜黃素干預造模組（CU）10只，所有小鼠在同等環境下飼養1周后開始試驗，基礎飲食組全程自由飲食；造模組于1、4、7周首日腹腔注射AOM（10 mg/kg），然后自由飲用2.5%DSS藥水3天后改為自由飲水［7］；干預組在造模開始后進行姜黃素隔日灌胃（200 mg/kg）至處死。分別于實驗前和處死前收集小鼠糞便，-80℃冰箱保存備用。

DNA提取及高通量測序：采用德國QIANEN公司生產的QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便樣品微生物的總DNA，具體步驟按照說明書操作，所提取的DNA于-80℃保存。高通量測序擴增細菌16SrRNA的421～460 bp區 域， 上 下 游 引 物 分 別 為 421F5?-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3?，460R5?-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3?。將得到的PCR產物構建測序文庫，采用Illumina Miseq平臺測序，對高質量測序數據進行生物信息學分析，該部分由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

三、統計學分析

統計學處理采用SPSS 21.0軟件，計量數據以（x±s）表示，多組間差異采用方差分析，對于不滿足正態分布或方差齊性的數據采用Welch檢驗和Brown-Forsythe檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。基于樣品測序產生的OTU結果，采用Qiime軟件計算beta多樣性距離矩陣，并用R語言vegan軟件包作非線性多維標度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）。

結 果

一、小鼠體重及成瘤變化

造模組與姜黃素組小鼠在后期的體重增量中，造模組小鼠體重增量平均要少于姜黃素干預組（見圖1）。在第7周處死小鼠時發現，姜黃素組小鼠結直腸腫瘤的成瘤數量、瘤體體積（見圖2、3），明顯小于造模組，提示在腫瘤的發生過程中，姜黃素起到了抑制腫瘤生成的作用。

二、測序序列及測序深度

在44例樣本中，總共獲得2 373 451條原始序列，經過質量過濾且Index完全匹配的有效序列和去除嵌合體之后的優質序列數為1 596 185，樣本序列長度主要集中在421～460 bp區域。為了便于進一步研究，對所有有效序列進行了OUT聚類，并按照最小樣本序列數進行了抽平，最終獲得339OUT單元。（見圖4）。

圖1 小鼠體重增長圖

圖2 造模組及姜黃素組成瘤圖片

圖3 成瘤數目及載瘤負荷圖

三、稀釋曲線及豐度分布曲線

在OUTs聚類完成的基礎上，我們進行稀釋曲線和豐度曲線的繪制，稀釋曲線圖中可以看出開始時曲線快速上升，說明隨測序深度增加，新發現的細菌種類也增加；隨著測序深度增加（序列數目增多），曲線趨于平緩，當序列數達一定數目時，基本處于平臺期，提示測序深度可以覆蓋所有細菌物種。從物種豐度曲線可以看出，相對豐度過高的菌種在各樣本中較少，隨樣本中物種組成豐富度的增加，曲線越平坦，物種組成的均勻度也就越高，不同樣本在不同的豐度達到平臺期，多數樣品所測得OTUs豐度在10至200區間。見圖5。

四、Alpha多樣性分析

通過組間差異檢驗可以看出，T1點（干預前）時各組小鼠的多樣性指數差異無統計學意義，T2點（干預后）時MO組的多樣性指數更高，高于其他2組，與BD組比較差異有統計學意義（t=2.73，P=0.02），與CU組比較差異無統計學意義（見表1、2）。另外可以看出T2點時各組的多樣性指數均較T1點時明顯升高，其中CU組與BD在T2點時多樣性指數更接近，均小于造模組，提示化學誘導成瘤過程中，小鼠腸道菌群結構出現變動，而姜黃素能維持腸道菌群相對穩定。

五、各組在門水平的比較分析

對優質序列按照不同相似程度進行聚類獲得OUTs，每一OUT中選一條代表性序列同已知數據庫比對、注釋分析，獲得該序列代表的細菌信息。分別按門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）水平統計結果。圖6為各小鼠腸道菌群在菌門（Phylum）水平構成的柱狀圖。可以看出各組小鼠腸道菌群在門水平有其特異性，但是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）以及變形菌門（Proteobacteria）為主要優勢菌門。其他如放線菌門（Actinobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）也存在于大部分樣品中，但豐度均小于1%。另外可以看出優勢菌門的物種在干預前后發生了變化，為了更直觀準確的對比菌群的變化，我們對基礎組、造模組和姜黃素組小鼠腸道菌群在門水平上進行了對比分析統計（見圖7），從統計圖中我們可以直觀的看出，基礎飲食組的腸道菌群在測序前后無明顯變化，排除了飼養環境引起的菌群變化因素；造模組和基礎飲食組干預前后腸道菌群在門水平沒有明顯變化，而姜黃素組改變較大，表現為干預后擬桿菌門（Bacteroidetes）增加，厚壁菌門（Firmicutes）減少，差異有統計學意義（P＜0.05），另外疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）以及放線菌門（Actinobacteria）干預后也有少量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預后造模組與姜黃素組對比，姜黃素組擬桿菌門（Bacteroidetes）較少，疣微菌門（Verrucomicrobia），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 序列長度分布圖

圖5 稀釋曲線及豐度分布曲線圖

表1 T1點（干預前）Alpha多樣性指數表

表2 T2點（干預后）Alpha多樣性指數表

圖6 門水平小鼠腸道菌群柱狀圖

六、各組在屬水平的比較分析

從菌屬水平可以看出，造模組與姜黃素組干預前后菌屬發生了很大改變，造模組干預前后變化有統計學意義的菌屬有：Blautia（P＜0.05）、Unclassif i ed_f__Enterobacteriaceae（P ＜ 0.01）、Parabacteroides（P ＜ 0.001）、unCUltured_f__Ruminococcaceae（P ＜ 0.01）、Lactobacillus（P＜0.05），姜黃素組干預前后變化有統計學意義的菌屬有：norank_f__Bacteroidales_S24-7_group（P＜0.001）、Akkermansia（P＜0.05）、Blautia（P＜0.01）。為了進一步觀察造模組和姜黃素組干預后菌屬有無區別，我們對二者進行了比較，結果發現Akkermansia在姜黃素組富集，而Parabacteroides在造模組富集，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖8。

討 論

近年來，從中藥中分離提取有效成分進行抗癌研究逐漸成為研究熱點，姜黃素便是其中之一。既往的研究表明，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等作用。眾所周知，腸炎是引起腸癌的重要原因之一。姜黃素作為一種較安全的中藥成分，人們在之前就已經開始了姜黃素作用于腸炎的研究［8］，作為對現有治療的補充。但是，姜黃素生物利用度非常低，限制了它作為藥物的應用。

近年來，隨著腸道菌群的改變對腸癌發生發展的研究越來越多，人們意識到腸癌的發生和腸道菌群也有著密不可分的關系［9-10］，口服姜黃素生物利用率低，但是在腸道內，姜黃素與腸道菌群直接作用，我們猜想姜黃素會與腸道菌群互相作用從而調節腸道菌群的構成，以此來進行對腸炎腸癌的預防。通過使用經典的造模方法，同時在造模的基礎上進行姜黃素的干預，我們設計了此實驗，并且通過高通量測序的方法，證明了姜黃素在預防腸癌的發生發展上，確實調整了腸道菌群的構成，并在一定程度上維持了腸道菌群的穩定。相比于造模組小鼠，姜黃素組小鼠的腸道菌群雖然在主要菌群中有比較大的變化，但是在種屬的分析上，我們可以看出，造模組的小鼠腸道菌群變化更大，而在姜黃素干預組小鼠變化中，我們可以看到屬于疣微菌門（Verrucomicrobia）的艾克曼菌（Akkermansia）有明顯的增加，在最近的研究中［11］已經確認艾克曼菌（Akkermansia）對于減少腸道炎癥有很重要的作用，通過我們的數據，我們可以認識到，姜黃素通過增加艾克曼菌抑制腸道炎癥從而減少腸癌的發生。但同時我們也可以看到，在我們的測序數據里面，最主要的擬桿菌屬發生了非常大的變化，而造模組的擬桿菌屬的變化卻沒有姜黃素組這么劇烈。結合我們既往的研究［12］，推斷在造模成瘤的過程中，產毒脆弱擬桿菌屬在造模組中占據了主要地位，造成腸癌的發生，而姜黃素組抑制了此類菌種在腸道菌群中的組成，從而進一步抑制腸癌的發生。由于測序深度有限，我們無法在此文中給出確切的數據來證明我們的猜想。但是結合既往的研究結果，我們不難推斷出我們的實驗從一個基本面上證明了我們的猜想。綜合上述結果，我們可以認為，姜黃素一方面通過盡量維持腸道菌群的穩定性來減少腸癌的發生，另一方面，姜黃素也通過增加腸道內的益生菌，抑制有害菌屬的增加來抑制腸炎的發生發展，從而進一步的抑制腸癌的發生發展。

圖7 各組門水平小鼠腸道菌群差異圖。7A：BD組干預前后門水平菌群差異；7B：CU組干預前后門水平菌群差異；7C：MO組干預前后門水平菌群差異；7D：CU組與MO組干預后門水平菌群差異

圖8 各組屬水平小鼠腸道菌群差異圖。8A：MO組干預前后屬水平菌群差異；8B：CU組干預前后屬水平菌群差異；8C：CU組與MO組干預后屬水平菌群差異

綜上，本研究通過小鼠結直腸癌模型，初步探究了姜黃素可能的抑癌機制，為結直腸癌與腸道菌群相關性的研究提供了新思路。