sFRP2和Wnt/β-catenin通路在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用

史友權 崇楊 湯東 熊清泉,4 黃玉琴,5 周懷成 張琪 金芝祥,5王道榮

近年來結直腸癌發(fā)病率愈來愈高，在全球腫瘤中發(fā)病率位于第三位，致死率位于第二位［1］。有研究認為 sFRP2（Secreted Frizzled-related proteins 2）表達減少或消失，導致與Wnt蛋白競爭性結合減少，Wnt/β-catenin通路被激活，β-catenin異常表達從而促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［2-3］。目前關于sFRP2對結直腸癌細胞株HCT116細胞的增殖、遷移、侵襲等研究鮮見相關報道。我們檢測了正常結直腸黏膜組織和結直腸癌組織中sFRP2和β-catenin的表達，以及在結直腸癌細胞株HCT116轉染上調sFRP2后，對比轉染前后細胞增殖、遷移和侵襲方面的變化，以探討sFRP2和Wnt/β-catenin通路在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、材料

1.細胞和組織：結直腸癌細胞株HCT116來源于江蘇省蘇北人民醫(yī)院實驗中心。谷歌生物科技有限公司幫助構建包含sFRP2蛋白全長的pcDNA3.1質粒。結直腸組織標本來源于江蘇省蘇北人民醫(yī)院2015～2017年手術切除或內鏡活檢確診的標本，正常結直腸黏膜標本32例（非結直腸癌患者），結直腸癌標本32例，共64例，所有結直腸癌患者術前均未行放化療，臨床病理特征詳見表1。

2.主要試劑：兔抗人sFRP2多克隆抗體（Abcam）、兔抗人β-catenin抗體（Santa Cruz）、免疫組化試劑盒（凱基生物）、胰蛋白酶（凱基生物）、Western Blot試劑盒（凱基生物）、CCK-8試劑盒（Dojindo）、胎牛血清（杭州四季青）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、脂質體Lipofectamine TM3000（Invitrogen）、Transwell小室（Corning Corstart）和Matrigel基質膠（BD）。

二、實驗方法

1.免疫組化（SP）：選取上述結直腸組織標本，經福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋后切片。依次使用二甲苯常規(guī)脫蠟、酒精梯度復水和抗原修復后，根據免疫組化試劑盒說明書進行后續(xù)實驗。每批均設置陰性和陽性對照，陰性對照：PBS替代一抗，陽性對照：已確定的sFRP2、β-catenin表達陽性的結直腸組織。

我們根據以下標準判定sFRP2和β-catenin的染色情況：（1）sFRP2染色結果根據染色強弱和細胞陽性表達率進行綜合評分。1）染色強弱：0分（無染色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）。2）細胞的陽性表達率：0分（≤25%），1分（26%至50%），2分（51%至75%），3分（大于76%）。綜合兩者進行評分，依據評分判定結果，陽性（＋）：兩項評分之和大于3；陰性（-）：兩項評分之和小于等于3分。（2）β-catenin：細胞出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。膜正常表達：細胞膜染色程度大于70%；膜表達缺失：小于等于70%；胞漿或胞核陽性表達：胞漿或胞核陽性率在同類細胞中比例大于10%，兩者都稱為異位表達。異位表達和膜表達缺失統(tǒng)稱異常表達［4］。

表1 sFRP2和β-catenin與結直腸癌臨床特點的關系（例）

2.細胞培養(yǎng)及轉染方法：培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基＋培養(yǎng)箱（37℃和5%CO2）。使用LipofectamineTM3000轉染試劑在細胞對數生長期轉染pcDNA3.1質粒。實驗分為3組：（1）對照組：未轉染。（2）空載質粒組：轉染空白質粒。（3）sFRP2轉染組。轉染過程依據轉染試劑說明書進行。

3.Western blot：細胞經過處理后，加入RIPA裂解緩沖液。首先使用SDS/PAGE凝膠電泳分離蛋白質樣品，將其轉移到PVDF膜上，配備5%脫脂奶粉封閉液，將PVDF膜上浸泡1 h，依次與兔抗人sFRP2多克隆抗體（1:1000）和兔二抗（1:1000）反應，后進行曝光顯影。

4.CCK-8實驗：將1.0×104個細胞接種于96孔板，根據CCK-8試劑盒產品說明書進行細胞計數。簡而言之，向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，并將它們孵育1 h，然后在450 nm下測量吸光度，實驗重復3次。

5.劃痕實驗：將HCT116細胞接種于6孔板中，融合至80%～90%時，在孔板中心軸處用槍頭沿直線輕輕劃痕，然后用PBS除去細胞碎片。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在0 h、48 h進行觀察拍照。測量劃痕間的距離，實驗重復3次。

6.Transwell實驗：Transwell小室底部膜由Matrigel基質膠包被（濾膜孔徑為8 μm）。上室：無血清DMEM培養(yǎng)基（含細胞），下室：10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h。除去上室細胞后，用多聚甲醛中固定15 min，染色20 min。隨機選取5個視野（100倍）進行細胞計數，取其平均值。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。t檢驗應用于計量資料，χ2檢驗或Fisher精準檢驗應用于計數資料，Spearman分析用于檢驗相關性。組間比較選用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、免疫組化

1.sFRP2和β-catenin在結直腸組織中的表達：我們分別對正常結直腸黏膜組織和癌組織兩組進行了免疫組化檢測，正常結直腸黏膜組織中sFRP2主要在細胞質里表達（圖1A），β-catenin主要在細胞膜上表達（圖1C）。結直腸癌組織中sFRP2低表達或不表達（圖1B）。而β-catenin異常表達增加（圖1D）。兩組在sFRP2的陽性率、β-catenin膜表達缺失率及異位表達率等方面表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），正常黏膜組織中sFRP2的陽性率顯著高于結直腸癌組，結直腸癌組中β-catenin膜表達缺失率和異位表達率癌顯著高于正常結直腸黏膜組。詳見表2。

2.sFRP2和β-catenin與結直腸癌臨床特點的關系：如表1所示，sFRP2陽性表達、β-catenin膜表達缺失、異位表達與腫瘤組織分化存在明顯差異（χ2=5.420，P=0.020；χ2=6.472，P=0.011；χ2=7.158，P=0.007），而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結轉移無關（P＞0.05）。

3. 相關性分析：通過Spearman分析，我們研究發(fā)現sFRP2表達分別與β-catenin膜表達缺失（r=-0.39，P=0.03）及β-catenin異位表達（r=-0.47，P=0.01）負相關，β-catenin異位表達與β-catenin膜表達缺失正相關（r=0.50，P=0.004），且相關性均顯著。詳見表3。

二、Western blot檢測

Western blot結果驗證了轉染后sFRP2的表達水平顯著高于轉染前（t=25.430，P=0.001），β-catenin表 達 水 平 亦 較 前 提 高（t=15.000，P=0.001），β-actin作為內參。如圖2所示。

三、CCK-8實驗

通過CCK-8方法檢測發(fā)現，sFRP2轉染組分別與對照組和空載質粒組比較［12 h：（t=0.016,P=0.988）和（t=0.041，P=0.970），24 h：（t=0.155,P=0.884）和（t=0.452，P=0.675），36 h：（t=0.695,P=0.525）和（t=1.173，P=0.306），48 h：（t=1.254,P=0.278）和（t=1.693，P=0.166），60 h：（t=3.440,P=0.026）和（t=3.576，P=0.023）］，細胞增殖速度明顯減慢（圖3），說明sFRP2抑制了結直腸癌細胞HCT116的增殖。

四、劃痕實驗

通過比較sFRP2轉染組、空載質粒組和對照組三組HCT116細胞劃痕兩側直線間的距離，來判斷sFRP2對HCT116細胞遷移能力的影響。結果發(fā)現：sFRP2轉染組劃痕兩側距離與空白組、空載質粒組比較，遷移速度明顯較慢［（t=16.890，P=0.001）和（t=7.206，P=0.002）］，表明sFRP2抑制了癌細胞的遷移。如圖4所示。

五、Transwell實驗

通過Transwell實驗我們發(fā)現，對照組透膜（195.39±8.68）個，sFRP2轉染組透膜（75.69±7.19）個，對照組透膜細胞數明顯多于sFRP2轉染組（t=25.459，P=0.001），如圖5所示。

討 論

圖1 sFRP2和β-catenin在結直腸組織中的的表達。1A：正常結腸組織（sFRP2）；1B：結直腸癌組（sFRP2）；1C：正常結腸組織（β-catenin）；1D：結直腸癌組（β-catenin）（免疫組化SP法×400）

表2 sFRP2及β-catenin在兩組中的表達情況［例（%）］

表3 結直腸癌中sFRP2和β-catenin表達的相關性（例）

圖2 轉染前后HCT116細胞中sFRP2、β-catenin的表達（sFRP2及β-catenin轉染前后相比*P＜0.05）

sFRP2是sFRP家族7個成員之一，結構上與卷曲蛋白相似，均含有半胱氨酸富集區(qū)（cysteine rich domain，CRD）。一方面，sFRP2通過CRD與Frizzed競爭結合到Wnt蛋白上抑制Wnt通路；另一方面，sFRP2與Frizzed結合生成無功能的復合物，封閉Wnt信號通路［5］，從而抑制腫瘤的發(fā)生。當sFRP2表達減少時，與Wnt蛋白競爭性結合減少，不能阻斷或封閉Wnt通路，導致Wnt通路激活，便起到了促癌的作用［6-7］。我們研究發(fā)現sFRP2在正常結直腸黏膜組中的陽性表達率（100%）顯著大于結直腸癌組（28.1%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這與劉寧等［8］研究結果相一致。有研究報道結直腸癌中sFRP2甲基化，可導致sFRP2表達水平下降或沉默［9-11］。

圖3 sFRP2對結直腸癌HCT116細胞生長曲線的影響（sFRP2轉染組與對照組相比*P＜0.05）

圖4 sFRP2對結直腸癌細胞HCT116細胞遷移能力的影響（sFRP2轉染組與對照組相比*P＜0.05）

Wnt是分泌型、脂質修飾的糖蛋白，其在胚胎發(fā)育過程中具有許多關鍵作用，并促進成年人的組織平衡。它們可以調節(jié)細胞的分化、增殖、遷移、存活和干細胞自我更新［12-14］。異常Wnt信號與許多疾病相關，特別是癌癥［15］。Wnt/β-catenin通路是目前結直腸癌發(fā)生進展機制研究的熱點［16］，當Wnt通路激活時，β-catenin不被降解，進入細胞核并積聚，β-catenin出現膜表達缺失和異位表達，與轉錄因子相互作用，啟動轉錄，調控基因表達，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［17］。我們研究發(fā)現：β-catenin膜表達缺失率在結直腸癌組（53.7%）顯著大于正常結直腸黏膜（0%），β-catenin異位表達率在結直腸癌組（61.1%）顯著大于正常結直腸黏膜（0%），且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這與相關研究［8］結果相一致。

圖5 sFRP2對結直腸癌細胞HCT116細胞侵襲能力的影響（sFRP2轉染組與對照組相比*P＜0.05）

本研究發(fā)現sFRP2的表達和β-catenin異常表達均與組織分化明顯相關（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結轉移無關（P＞0.05），這與相關研究［8，18-19］結果相一致。我們通過檢測發(fā)現，發(fā)現sFRP2的陽性率與β-catenin的膜表達缺失率及異位表達率均呈負相關，β-catenin的膜表達缺失率和異位表達率呈正相關，與劉寧等［8］和潘世杰［20］相關研究報道一致。主要因為sFRP2的表達減少，導致Wnt通路激活，從而引起β-catenin表達的變化。

目前，在結直腸癌細胞株HCT116中轉染上調sFRP2后研究其對細胞的增殖、遷移和侵襲的研究尚缺乏。我們研究發(fā)現sFRP2上調后細胞增殖速度顯著減慢，抑制HCT116細胞的增殖。肖燦［21］通過質粒轉染上調人舌鱗癌細胞系Tca8113細胞中sFRP2的表達，發(fā)現sFRP2的過表達顯著抑制了細胞的增殖。sFRP2表達水平下降導致Wnt/β-catenin通路的激活，進而β-catenin進入胞漿和胞核并積累，與CyclinD1啟動子中的LEF-1位點相互作用，激活轉錄過程，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）被激活后，誘導磷酸化，促進基因轉錄，促使細胞完成由G1期到S期的轉換，并進入增殖期［22-23］。所以sFRP2表達水平升高阻斷或封閉Wnt/β-catenin通路，則抑制了細胞的增殖［24］。通過劃痕實驗，我們發(fā)現sFRP2抑制了細胞的遷移能力。通過Transwell實驗我們發(fā)現sFRP2轉染組透膜細胞數明顯小于對照組透膜細胞數，說明sFRP2抑制HCT116細胞的侵襲能力。但是我們的實驗細胞比較單一，僅一種結直腸癌細胞，仍需要進一步在其他結直腸癌細胞中進行驗證。

綜上所述，sFRP2是一種抑癌基因，通過調控Wnt/β-catenin通路而發(fā)揮其作用。sFRP2結直腸癌細胞株HCT116中轉染上調后，明顯抑制了結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。希望本研究能為結直腸癌的治療提供新的靶點和思路。