一起雞源性巴氏桿菌病的診斷與防治

王 華，孫 娜，闞 威

(1.隴南師范高等專科學校，甘肅 隴南 742500；2.青海省動物疫病 預防控制中心，青海 西寧 810000)

雞巴氏桿菌病又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌(革蘭氏陰性菌)引起的傳染病， 以敗血癥和炎癥出血為主要示病特征[1]。 該病菌一般寄生在健康家禽的呼吸道中[2]，不引起感染，直至家禽機體抵抗力降低時， 細菌及毒素經淋巴液進入組織血液，引起內源性感染[3]且多為暴發性感染，發病率和至死率較高。 根據該疾病暴發時臨床癥狀表現可分為： 最急性型、急性型和慢性型。最急性型常發生于流行初期，主要表現為雞沒有任何先兆的突然死亡，且以肥胖雞或高產蛋雞居多。 隨后即出現急性型病雞。 病雞發病快、死亡快，以敗血性經過和劇烈下痢為主要特征，主要表現為體溫較正常雞的高2～4℃，因呼吸困難，繼而特征性癥狀是張口搖頭，因此也被稱之為“搖頭瘟”[4]。慢性型則主要多發生于疫病流行后期，通常表現為雞冠肉髯紅腫、并伴發有慢性呼吸道炎和胃腸炎，個別家禽會不同程度出現跛行、關節炎等癥狀。禽霍亂的發生無明顯的季節性，四季均可出現，但該細菌不耐受低溫，夏季發病率明顯高于冬季，家禽以7～10月齡為發病高峰，呈散發性或地方流行性[5]。

2017年7月底至8月初，青海省大通縣境內某母養雞場1棟雞舍(10000羽)28只蛋雞突然死亡， 部分蛋雞陸續出現精神沉郁、雙翅耷拉、羽毛蓬松無光澤、小部分病雞關節腫大，跛行，雙趾外展，并伴有噼叉和行走困難等癥狀。患病雞少食甚至不飲不食，呼吸困難并伴隨腹瀉癥狀，排出灰白色或淡綠色稀糞，泄殖腔周圍羽毛污穢。剖檢頻死雞3只，僅見肺臟有出血，肝臟腫大，并可見條紋狀出血斑， 腎臟腫大較嚴重，其中1只雞脾臟腫大，關節腫大部位有類似結締組織贅生物。 剖檢已死亡雞2只，嗉囊無食物，極度消瘦。 剖檢出現急性死亡的病雞，可見心臟表面及內膜覆蓋著米粒大小的出血點，心包膜變厚變硬，且內有淡黃色積液充盈，腹膜微量出血，肝臟大而脆，并有灰白色出血點覆蓋。剖檢初步懷疑為雞馬立克氏病，但剖檢的5只雞均未見腹腔神經叢、前腸系膜神經叢、臂神經叢和坐骨神經叢病變， 可排除雞馬立可氏病，初步定性為禽霍亂。

為進一步確診并控制疫情，青海省動物疫控中心對病料進行了實驗室診斷即細菌分離鑒定，并通過動物試驗進一步確定。同時進行了藥敏試驗，以對大通縣境內禽霍亂的藥物治療提供參考。

1 材料

1.1 主要試劑

本實驗所用的試劑、來源見表1。

表1 試劑及來源

1.2 試驗動物

健康昆明小鼠12只，6～8周齡，18～20g，SPF級，購自青海大學。

1.3 病料

青海省西寧市大通縣某發病雞場。

2 方法

2.1 病料采集

按常規剖檢方法解剖病死雞5只，頻死雞3只，已死亡2只。分別編號雞1～5#,無菌條件下采集病變雞的脾臟(1p～5p)、肺臟(1f～5f)、腎臟(1s～5s)、肝臟(1g～5g)，4℃冷藏，帶回實驗室，待檢測。

2.2 涂片鏡檢

在無菌條件下剪開雞1～5#的肝、脾、肺、腎，迅速將剪開的新鮮創面在玻片涂勻，形成一層薄凝固膜，酒精燈上部烘烤固定，干燥，制成觸片，分別瑞士和革蘭氏染色，鏡檢。

2.3 分離純化

無菌條件下，隨機選擇5組病死雞的心臟血和肝臟，劃線接種于營養瓊脂平板上，37℃，18～24h，觀察接種菌的增殖情況和菌落狀態，從中挑取一單個菌落革蘭氏染色鏡檢，做定性判斷。隨后挑取平板上的長勢較好的濕潤單菌落接種于營養肉湯培養基中，于37℃增殖。之后取肉湯中的純培養菌分別劃線接種于TSA、麥康凱、三糖鐵、綿羊血瓊脂等培養基中，溫箱37℃，24h，觀察各培養基中細菌生長、菌落形態及溶血情況等，同時封存兩株分離菌，以備后續實驗使用。

2.4 生化鑒定

取2.3中各培養基純化的巴氏桿菌2株于微量生化鑒定管，根據常規方法試驗，觀察。

2.5 攻毒試驗

取2.3中含有增殖細菌營養肉湯分別注射于小鼠(0.3mL/只)6只腹腔內，無菌營養肉湯注射小鼠2只，作為對照。觀察小鼠發病死亡情況，立即剖檢死亡小鼠，取病變組織涂片、分離、純化、增殖、鑒定。

2.6 藥敏試驗

藥敏試驗采用Kirby-Bauer法，取2.3肉湯中的增殖菌，并調整至濃度為0.5麥氏單位.移液槍吸取調整好的菌液80μL，涂布棒平鋪于M-H上，1h后夾取藥敏紙片于培養基表面，倒置37℃，24h，游標卡尺測定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準判定分離純化該雞場的禽巴氏桿菌對常用抗生素的敏感度。

3 實驗結果及分析

3.1 細菌形態與鏡檢結果

2.2中的涂片和觸片美藍染色，鏡檢，可見兩極濃染、兩端鈍圓的短桿菌；革蘭氏染色，鏡檢，細菌紅染，屬革蘭氏陰性短桿菌，散在或成對存在。

圖1 革蘭氏染色結果

3.2 細菌培養特性

將接種于營養瓊脂培養基上的禽巴氏桿菌生長較好，菌落濕潤光滑，乳白色，邊緣整齊，呈圓形或橢圓形，直徑約1mm，折光下，菌落邊緣可折射出微弱的淡藍色光；麥康凱培養基中菌落干燥，無增殖菌落出現，表示不生長；在5%綿羊血瓊脂培養基中雖有濕潤光滑的露珠狀小菌落再生，但無溶血環出現，表示不溶血。在三糖鐵培養基中有零星的小菌落出現，新鮮菌落數目較少，增殖不明顯且培養基底部顏色變黃，表示Fe3+部分被還原。

3.3 細菌生化鑒定

分離純化的禽巴氏桿菌其生化鑒定結果見表2，國外參考株的生化結果與分離株的生化結果無差異，符合多殺性巴氏桿菌的生化特點。

3.4 致病性試驗結果

用上述生化鑒定的同株菌對小鼠進行攻毒試驗。腹腔注射增殖菌的6只小鼠18h內全部死亡，對照組小鼠均健康。解剖其中死亡的小鼠4只，均可見明顯的肺臟充血，干細胞大量的變質壞死，并伴有出血，腸道呈卡他性病變。取死亡小鼠的心血涂片，革蘭氏染色鏡檢，視野內充滿紅色短桿菌。

3.5 藥敏試驗結果

應用購置的20種藥敏紙片分離菌進行藥敏試驗，結果見圖2，表3。

表2 分離株生化鑒定結果

圖2 分離株藥敏實驗

實驗結果表明分離菌株對頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿奇霉素、卡那霉素、阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、氟苯尼考均表現出高度敏感性，對氨芐西林、鏈霉素和恩諾沙星中度敏感，對紅霉素、四環素、甲氧芐啶(TMP)均不敏感。兩菌株對慶大霉素、強力霉素(多西環素)、氧氟沙星、復方新諾明敏感性不一，XH-1對這4種藥物高敏感，但XH-2對慶大霉素表現為中度敏感，對其他3種藥物均不敏感(見圖2和表3)。

表3 分離株的藥敏實驗結果

表3(續)

注：S為敏感，I為中介，R為抗藥

4 討論

多殺性巴氏桿菌是限制畜牧業發展的重要病原菌，不僅引起禽類的大量死亡[6]，還可引起豬肺疫[7]，兔膿血癥[8]等疾病，而且可協同其他病原菌于人的呼吸道，引發敗血癥，威脅人類健康[9]。

本試驗是從規模化的養雞場突然發病而采集的病料，通過最基本的實驗室分離鑒定，獲得致病菌。通過參照《獸醫微生物學》[10]、《獸醫實驗室診斷手冊》[11]、《獸醫微生物學實驗指導》[12]等教材的具體的表述進行鑒定，革蘭氏和瑞士染色、鏡檢，根據不同培養基內的培養的不同特點、葡萄糖等生化試驗的特異性鑒定，證明出分離培養純化的的細菌為禽多殺性巴氏桿菌。攻菌后的小鼠病理變化主要集中小鼠的消化系統，其中肝臟和小腸最為明顯。從肝臟和心臟血液中涂片染色的結果與雞場中采集的病死雞的肝臟和心臟血液觸片的鏡檢的細菌形態完全一致，并且分別培養的特性和生化鑒定的結果完全一致菌，表明本試驗中分離的巴氏桿菌株具有較強的致病性。抗菌藥物在此次預防禽霍亂疫病的蔓延發揮了重要的作用，但由于抗生素的濫用，導致細菌耐藥性較強，因此所造成的后果是給本病的防控和治療帶來了很大困難。從藥敏試驗的結果可以看到，分離株所得的對試驗中的20種藥物敏感性結果存在差異，分離株對紅霉素、四環素等藥物產生了耐藥性，根據詢問飼養人員，這可能與平日預防治療其他禽病所用的藥物種類和數量有關。使用頭孢他啶等高度敏感的藥物用于本病治療，同時配合每日2次新潔爾滅消毒，2周內未有新的病例出現，使疫情得到控制，預防和治療效果較為顯著，高效。但是必須聲明的是:在頭孢他啶等高度敏感的藥物的使用時不可連續反復使用同一種藥物，可交替換藥或輪換用藥，根據不同的藥理學配伍和作用對癥下藥，與此同時必須嚴格控制用藥劑量，避免濫用抗生素。

禽霍亂疫情的發生可使家禽易感染，并且具有較高的死亡率高，因此在家禽的養殖過程中一定要注意該疾病的防控，并且嚴格控制種內種間的傳染。對于規模化的養殖場，特別是養雞場要做好預防工作。目前我國雞巴氏桿菌病疫苗主要是菌苗，但禽巴氏桿菌血清型多(16種)、交叉免疫力低，導致疫苗免疫效果不理想[11]。因此，從本養殖場病死雞中分離雞多殺性巴氏桿菌制成菌苗或基于其毒力因子外膜蛋白(OMP)制成亞單位疫苗，較傳統的疫苗具有明顯的特異性和靈敏性[13]，對本養殖場巴氏桿菌病的預防效果較好，但還未得到推廣。由于禽霍亂的致病菌屬于條件性致病菌，在高溫、潮濕、飼養管理不當、飼養衛生較差、通風不良等外界環境較差的誘因下促進本病的發生。因此，飼養人員必須嚴格做好日常環境消毒、給予家禽全價飼料，及時補充蛋白質和維生素，加強飼養管理、增強雞體自身的免疫力才是預防本病的最重要的措施。