滋養(yǎng)肝腎法對初老模型大鼠卵巢儲備功能下降的調(diào)節(jié)作用及機制

包紅桃 謝知慧 李應福 王寶泉 晏 鵬 董娟娟 劉雙萍 武權(quán)生

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

卵巢儲備功能(OR)是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育、形成可受精卵泡的能力，反映女性生育潛能和生殖內(nèi)分泌功能〔1,2〕。卵巢儲備功能下降(DOR)指卵巢產(chǎn)生卵子能力減弱、卵泡質(zhì)量下降，導致女性生育能力下降及性激素缺乏，臨床多表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、經(jīng)期不規(guī)則、閉經(jīng)、不孕等〔3〕，DOR時卵巢抑制素生成減少，對垂體的抑制作用減弱使促卵泡生成素(FSH)分泌增加，而內(nèi)源性FSH 的持續(xù)升高可加速竇卵泡的消耗。如不積極干預最終將導致卵子的耗竭發(fā)生卵巢早衰，失去最佳治療機會。DOR發(fā)生與年齡、婚育狀況、宮腔操作次數(shù)、心理、吸煙、減肥藥服用史、雷公藤服用史、卵巢手術史、腮腺炎病史等諸多因素有關〔4〕。DOR發(fā)生率為10%〔5〕，是一個漸進性過程，常在 1～6 年內(nèi)發(fā)展為卵巢衰竭。現(xiàn)有DOR中醫(yī)、西醫(yī)治療手段都有不同的局限性〔6～12〕。近年來，致力于中醫(yī)藥改善OR的研究、探索日益增多，并已取得顯著臨床療效。傳統(tǒng)中醫(yī)診治疾病的整體觀念與辨證論治原則顯得尤為重要。本研究旨在闡釋中醫(yī)藥改善DOR的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用自然老化的初老模型，SPF級SD大鼠，雌性，12～13月齡，體重240～440 g；5月齡青年大鼠，體重180～220 g。由甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室提供。實驗過程室溫保持(21±2)℃，相對濕度60%～70%，動物購進后適應性喂養(yǎng)4 d。

1.2實驗藥物 所需中藥材均由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房同一批購進。戊酸雌二醇片(補佳樂，生產(chǎn)廠家：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：國藥準字J20130009，劑型：片劑，規(guī)格：1 mg×21片，批號：國藥準字J20130009)。實驗試劑：FSH和黃體生成素(LH)試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3實驗方法 以陰道上皮角化試驗驗證模型〔13,14〕。按大鼠動情周期陰道涂片的細胞變化特點來劃分動情周期的各階段。通過陰道脫落細胞分析對60只13周齡SD雌性初老大鼠連續(xù)15 d進行陰道涂片、鏡檢，觀察陰道組織涂片中細胞的變化，記錄圖像并分析。篩選出50只動情周期紊亂、動情間期延長提示DOR模型大鼠后隨機分為模型組、組方高劑量組、組方中劑量組、組方低劑量組、補佳樂組。5月齡雌性大鼠10只為青年組。

1.3.1給藥 除模型組、青年組灌服等體積生理鹽水外，其余各組均按體表面積折算成人的等效劑量給藥，組方高(2.12 g·kg-1·d-1)、中(1.06 g·kg-1·d-1)、低劑量組(0.53 g·kg-1·d-1)，每日2次；補佳樂組0.03 g·kg-1·d-1，1次/d，均連續(xù)7 d。

1.3.2標本采集 陰道脫落細胞采集方法：用自制的無菌棉簽蘸取少量生理鹽水浸濕后插入大鼠陰道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上輕輕滾動，使分泌物均勻涂布于玻片上，待涂片自然風干后，以95%的酒精固定、瑞氏染色。最后一次灌胃后1～2 h眼眶采血，離心后，取上清液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)監(jiān)測FSH、LH(按試劑盒說明操作)，處死大鼠摘取卵巢，用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察卵泡數(shù)量。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，方差齊者采用Bonferroni法，方差不齊者采用DunnettT3法。

2 結(jié) 果

2.1各組血清FSH、LH的表達 與模型組比較，組方高、中、低劑量組、補佳樂組血清FSH、LH明顯降低(P<0.05)，模型組血清FSH、LH值顯著高于青年組(P<0.05)；補佳樂組血清FSH、LH值顯著低于組方高、低劑量組(P<0.05)，而與組方中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；組方高、中、低劑量組、補佳樂組能明顯降血清FSH、LH表達水平，且中劑量組效果最顯著(P<0.01)。見表1。

2.2各組卵泡數(shù)量 青年組表現(xiàn)為卵巢體積大，卵泡生長活躍，可見各級卵泡，顆粒細胞層次多，卵泡液含量多，黃體發(fā)育良好，體積大，血管豐富；模型組可見卵巢萎縮，卵泡數(shù)減少，無黃體，卵母細胞顆粒層數(shù)減少，閉鎖卵泡數(shù)增多，卵泡內(nèi)細胞排列出現(xiàn)紊亂；組方高、低劑量組可見卵巢略有萎縮，卵泡數(shù)略有增多，黃體數(shù)量略少，卵母細胞顆粒層數(shù)較多；組方中劑量、補佳樂組可見卵巢體積正常大小，各級卵泡數(shù)均較多，卵泡液含量多，黃體數(shù)較多，卵母顆粒細胞層次增多，以組方中劑量組尤為明顯。見圖1。

表1 各組血清 FSH、LH表達水平

與青年組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與補佳樂組比較：4)P<0.05

圖1 各組卵巢組織中卵泡數(shù)量(×10)

3 討 論

中醫(yī)藥防治DOR從多方面、多環(huán)節(jié)入手，對人體具有整體調(diào)節(jié)作用，中醫(yī)藥補腎活血，調(diào)肝健脾、滋陰補腎、補腎祛瘀等效果顯著〔15，16〕。西醫(yī)常采用激素治療DOR，但其副作用較大，患者服藥期間易擅自停藥等。應用“肝腎同源，精血互生”病機理論，從整體出發(fā)，辨證論治，具有整體調(diào)控和多靶點、多方式調(diào)節(jié)的特點。臨床經(jīng)驗方滋養(yǎng)肝腎組方加以優(yōu)化后篩選出以炙黃芪35 g、淫羊藿15 g、生地12 g、熟地15 g、枸杞15 g、當歸20 g、鹽澤瀉12 g、茯苓15 g、太子參30 g、麩炒白術18 g、陳皮6 g、女貞子15 g、酒萸肉12 g、炒山藥15 g、炒白芍15 g、墨旱蓮15 g、何首烏15 g、酒黃精15 g、鹿角膠10 g、龜甲膠15 g、甘草6 g具有地域特色藥材為主的基本配伍組方，本研究說明滋養(yǎng)肝腎組方通過滋養(yǎng)肝腎調(diào)節(jié)機體生殖內(nèi)分泌功能，改善DOR的作用，從而穩(wěn)定機體內(nèi)環(huán)境。