miRNA-19a對結腸癌細胞增殖活性的影響

楊 庚 李 昱 賀亞峰

(西安市武警工程大學醫院檢驗科，陜西 西安 710086)

結腸癌在大多數國家的發病率呈上升趨勢〔1～3〕，資料顯示世界上新患結腸癌約120萬例/年，而死于此病的約60萬例/年〔4～6〕，結腸癌患者5年生存率仍然少于10%〔7〕。目前miRNA(miR)與腫瘤的相關性研究已成為熱點〔8〕。miR與腫瘤的發生發展及其細胞凋亡增殖等相關機制的調控有關〔9〕，由20～25個核苷酸組成的內源性非編碼小RNA〔10〕，能與靶基因 3′非翻譯區域的結合位點互補或不完全互補，促進其mRNA 降解或抑制翻譯參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等多個生物學過程〔11〕。多項研究證實不同差異的miR存在于結腸癌中〔12,13〕。而文獻指出在結腸癌高表達的一類miR就是miR-19a〔14～16〕。miR-17-92是首個被發現的非編碼致癌基因族〔17〕，該家族包括6個成員：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92a〔18〕。其中miR-19在多種癌癥中高表達,使其凋亡能力減低〔19,20〕。上調miR-19使細胞增殖和惡變作用加強，是通過抑制B細胞淋巴瘤中抑癌基因同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)的表達途徑實現的〔21〕。源于各種組織的miR表達譜可能存在差別〔19,22〕，當檢測到異常的miR時，可根據其表達譜對多種低分化腫瘤進行分類〔15,23〕，它還與細胞周期的調控〔24〕及治療時藥物的敏感性相關〔25〕,由此可見miR對結腸癌的三級預防及防止復發等方面的用途值得深入探究。本文探討miR-19a對結腸癌LoVo細胞周期、細胞增殖凋亡及其侵襲力的作用。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌LoVo細胞購自中國醫學科學院，由陜西省醫學實驗動物中心實驗室冷凍保存。胎牛血清(FBS)、DMEM培養液(Gibco公司)；0.25%胰酶(Hyclone公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen,美國)；miR-19a模擬物、抑制物(GenePharma,上海)； CCK8試劑盒(上海和元生物)；碘化丙啶(PI)試劑盒(美國BD公司)；侵襲小室(Sigma 公司)； 人工基質膠(南方醫科大學研究所)。

1.2結腸癌LoVo細胞體外培養建立實驗模型及分組 實驗模型建立：凍存于液氮中的LoVo細胞復蘇后，在5%二氧化碳(CO2)、濕度飽和的條件下，并將箱內溫度設為37℃，DMEM培養液中加入100 μg/ml鏈霉素和100 μg/ml青霉素及10%滅活胎牛血清，然后進行培養，注意在培養液有變化時換液。細胞長滿瓶底70%～80%時傳代一次。細胞傳代后棄掉全部培養液，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)將其清洗干凈，導出,加入0.25%胰酶37℃消化2～3 min。當鏡下發現胞質回縮、細胞間隙擴大時，為停止其消化需要加入DMEM培養基。待用工具反復輕輕吹打細胞形成單細胞懸液后，1 000 r/min離心5 min，倒掉上清液。用新的含10%血清的DEME重懸細胞，接種在新的培養板中，取對數生長期的LoVo細胞為實驗細胞，將其鋪于6孔板中，即為實驗模型。實驗分組：轉染miR-19a模擬物組、空白對照組、轉染miR-19a抑制組。

1.3脂質體介導miR-19a轉染人結腸癌LoVo細胞 取對數生長期LoVo細胞，根據Lipofectamine2000說明書按照步驟轉染等量的miR-19a模擬物和miR-19a抑制物，100 pmol羧基熒光素(FAM)標記的hsa-miR-19a模擬物或hsa-miR-19a抑制物,分別加入5 μl Lipofectamine2000與250 μl Opti-MEM，混合，室溫下孵育5 min。將稀釋液輕輕搖勻，使其充分混合后室溫下孵育20 min，以形成轉染復合物。轉染復合物需加入實驗組的每個孔內，然后余下的孔每個都需要補齊無血清DMEM到2 ml，且對照組也加入。轉染后6～8 h更換為2%FBS培養基2 ml，置37℃常規培養待檢測，再等1～2 d后即可檢測〔26〕。

1.4檢測轉染后miR-19a基因的表達 實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈式反應(PCR)：從轉染miR-19a模擬物或抑制物24 h后的LoVo細胞中提取總RNA，1 μg總RNA用于逆轉錄，反應條件為16℃ 30 min,42℃ 30 min及85℃ 5 min 1 μl RT產物構建20 μl PCR體系擴增miR-19a及GAPDH,引物序：miR-19a：正義：5′-GGAGTTCCTGGACCAGTACG-3′，反義：5′-TTCTTGTGCTTGTG CCATGT-3′；GAPDH:正義5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反義5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。mRNA擴增參數為95℃預變性5 min,95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,擴增40個循環。miRNA擴增參數為95℃預變性5 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,擴增40個循環。相對表達量用2-△△Ct表示,其中SOCS3 mRNA的△Ct=Ct(SOCS3 mRNA)-Ct(GAPDH),miR-19a的△Ct=Ct(miR-19a)-Ct(U6),△△Ct = △Ct處理組-△Ct對照組〔17〕。

1.5利用CCK8試劑盒檢測細胞的增殖能力 將1.3中各組細胞于轉染后每過12 h給予100 μl/孔的CCK8。37℃孵育2 h后用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長下測定各孔吸光度，取各組平均吸光度，每組實驗重復3次〔17〕。

1.6流式細胞術檢測miR-19a對細胞增殖周期、細胞凋亡的影響 將1.3中各組細胞2 000 r/min離心5 min，第一次加入PBS洗滌2次，再離心去除PBS，離心后加入1 ml預冷乙醇，在4℃的溫度下一夜后重復操作即第二次加入含0.3% Triton和50 μg/ml RNaseA的PBS洗滌細胞2次，最后37℃孵育30 min離心，再加PBS洗2次后便可收集。將PI染液700 μl加入收集好的細胞中，在37℃避光條件下染色15 min。取104個細胞用于測定結果，取得樣品后軟件分析計算DNA含量得出細胞周期百分比。

培養好的LoVo細胞接種在6孔板內，5×105個/孔，第2天待其貼壁后轉染細胞，并將24、48 h的LoVo細胞置于試管中，按上述分組離心10 min(2 000 r/min)后棄掉上清液，用PBS 清洗2遍，在70%～80% 冰乙醇內保存，-20℃固定2 h以上，再離心10 min(2 000 r/min)，PBS漂洗后將PI染料150 μl 置于每孔，在室溫避光的條件下孵育30 min，過400目網篩后上機測得結果〔26〕。

1.7細胞侵襲小室法檢測細胞的體外侵襲力 首先構建侵襲小室，用5×105個/ml的250 μl細胞懸液，加入鋪好基質膠的Boyden小室的上室，將其置于24孔板中，而下室的每個孔中需加入一定條件下的200 μl培養液即建立好小室模型，隨機分組(按上述要求)。將其置于含5%CO2的37℃培養箱內，等1～2 d取出小室。用工具擦除聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上表面殘留的細胞和基質凝膠，隨即用70%甲醇浸泡PET 膜的下表面,固定30 min，再取出用未結合型蘇木素染色10 min。染色后在光鏡下記錄上、下、左、右、中5 個角度下室面的細胞數，結果取均數〔27〕。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-19a基因的表達 轉染miR-19a模擬物組miR-19a水平(0.80±0.09)較空白對照組(0.44±0.04)明顯升高(P<0.05)，轉染miR-19a抑制物組miR-19a水平為(0.23±0.02)，各組間有統計學意義(P<0.05)；并且說明miRNA-19a在結腸癌LoVo細胞呈高表達，見圖1。

圖1 各組miR-19a基因的表達

2.2細胞的增殖能力 轉染miR-19a模擬物組LoVo細胞的增殖能力(1.58±0.06)較空白對照組(1.06±0.05)明顯升高(P<0.05)。轉染miR-19a抑制物組LoVo細胞增殖能力(0.83±0.04)較空白對照組明顯下降(P<0.01)。提示miR-19a與結腸癌LoVo細胞的增殖能力呈正相關。

2.3細胞增殖周期及細胞凋亡 與轉染miR-19a模擬物組和空白對照組相比，轉染miR-19a抑制物組的凋亡率明顯升高，而且G2/M期所占的比例顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞周期分布及細胞凋亡比較

與轉染miR-19a抑制物組比較：1)P<0.05

2.4細胞的體外侵襲力 轉染miR-19a模擬物的侵襲能力大于其他兩組。見圖2。

圖2 各組LoVo細胞的侵襲能力(×200)

3 討 論

文獻指出，腫瘤組織中的miR也存在于癌癥患者的血液循環中，并且能反映它在組織中的表達程度，進一步說明miR對腫瘤早期診斷、早期預防及預后具有重要的作用〔28～30〕。研究顯示，miR在指導癌癥的診斷和治療方面有重要的作用〔31,32〕。研究顯示〔7〕，miR存在于結腸癌患者血液和結腸癌組織中，這類獨特小RNA在研究結腸癌的領域功不可沒。郭運生等〔11〕用軟件Pictar，TargegtScan 預測miR-19a的靶基因，發現它能與肝癌缺乏基因(DLC)1的3′UTR 端結合，并驗證了它與DLC1在促進結腸癌細胞增殖方面的作用。miR-19a在其他細胞中，通過靶定腫瘤壞死因子-α，Cullin5，正次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)1和氨肽酶樣蛋白1抗體(NPEPL1)等靶基因調控細胞的生物學行為〔33～35〕。本文結果認為miR-19a在結腸癌中有致癌基因的功能。現有研究表明，miR-19a 還可以對非小細胞肺癌起作用，原理就是通過調控組織因子表達和減少PC9細胞的體外增殖〔36,37〕。miR-19a對血液系統相關疾病的診斷也有一定作用〔38〕。而對于結腸癌患者，miR-19a致癌基因的作用應該是通過影響腫瘤細胞的增殖活性，即上調miR-19a的表達，細胞體外增殖能力增強，細胞周期S期細胞數增多，細胞凋亡減少，細胞的侵襲力增強；下調miRNA-19a的表達，細胞體外增殖能力降低，細胞周期S期細胞數減少，細胞凋亡增加，細胞的侵襲力降低。